人类锌指蛋白家族新基因ZNF641和突触小泡蛋白类似新基因hSVOP的克隆与功能研究

摘要

转录因子在多种细胞功能中担任了重要角色，包括细胞生长、增殖、调亡和细胞内的信号转导。人们已经鉴定了几个大的转录因子家族。在哺乳动物中，锌指蛋白是最庞大的家族。研究表明，锌指因子能调节多种在心脏表达的基因。为了研究与心脏发育和心脏疾病相关的基因，本文从人类胚胎心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个新的锌指基因，经国际基因命名委员会批准命名为ZNF641。ZNF641定位在染色体12q13.11区带，含一个KRAB-A框和5个C2H2型锌指。其cDNA全长4906个碱基，含一个1317碱基的开放阅读框，编码一个由438个氨基酸组成，分子量为49.5kDa的蛋白。Northern杂交分析表明ZNF641在成人组织中广泛表达，其中，在骨骼肌组织有高度表达，在心脏、肝脏和胰腺中有中度表达，在大脑，肾脏和肺中没有表达。通过构建增强型绿色荧光蛋白与ZNF641融合基因的真核表达载体，转染COS-7细胞系，瞬时表达后用荧光显微镜观察ZNF641融合蛋白的活细胞定位及表达，证明ZNF641蛋白在细胞核和细胞质中均有表达。报告基因分析证明ZNF641是一个转录激活因子，结构域分段分析表明ZNF641的KRAB-A框和C2H2锌指之间的连接部分(linker)是其转录激活的关键序列，可能是一个新的转录激活子。ZNF641在COS-7细胞中过表达能激活转录因子AP-1与SRE的活性，这两种因子是MAPK信号途径介导的重要因子，说明ZNF641蛋白可能在MAPK信号途径中作为激活因子介导细胞功能。综合该基因的结构和表达特征，本文初步得出结论认为：ZNF641是参与多种人类胚胎器官发生的锌指转录调控因子。此外本文还从人类cDNA文库中分离并鉴定了一个人类突触小泡类似新基因，经国际基因命名委员会批准命名为hSVOP。它类似于突触小泡蛋白SV2和SVOP，其cDNA序列全长为3556个碱基，开放阅读框长1646个碱基，编码548氨基酸的蛋白质。该基因定位在第12号染色体12q24.12区段。生物信息学分析表明其蛋白质包含12个跨膜结构域，是典型的跨膜转运蛋白质。Northern杂交结果表明该基因只在人类大脑组织中表达。鉴于hSVOP与大鼠中的SVOP基因高度同源(94﹪)以及我们的实验结果，我们推测，该基因产物可能是一个定位在突触小泡膜上的相关蛋白。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：中英文缩写词简表

第一章锌指蛋白与心脏发育研究

1.1锌指蛋白基因家族的概念和分类

1.2锌指蛋白基因的结构和功能

1.3锌指蛋白基因与心脏发育的关系

1.4锌指基因研究展望

第二章ZNF641基因的克隆、序列特征、组织的表达分析及其功能研究

2.1生物信息学软件

2.2材料与方法

2.2.1主要材料与试剂

2.2.2主要实验仪器

2.3 ZNF641基因的全长克隆

2.3.1引物设计与合成

2.3.2用巢式PCR反应从人类心脏cDNA文库中分离ZNF641

2.3.3凝胶回收

2.3.4连接实验

2.3.5感受态细胞的制备

2.3.6连接产物的转化

2.3.7重组克隆的筛选和鉴定

2.3.8质粒酶切

2.3.9 ZNF6415’RACE和3’RACE的扩增

2.4 ZNF641基因的序列特征分析结果

2.4.1 ZNF641的全长cDNA序列及蛋白质序列特征分析

2.4.2 ZNF641其同源基因的编码蛋白的同源性比较及进化分析

2.5 ZNF641基因的Northern表达分析

2.5.1Northern膜的制备

2.5.2 Northern杂交

2.5.3 Northern表达结果分析

2.6 ZNF641基因在亚细胞结构中的定位分析

2.6.1 PEGFP-N1-ZNF641重组质粒构建

2.6.2细胞培养及转染

2.6.3 EGFP-N1-ZNF641融合蛋白的亚细胞定位结果分析

2.7 ZNF641基因的初步功能研究

2.7.1 ZNF641的表达报告基因检测

2.7.2 ZNF641结构域分段研究

2.7.3实验结果的讨论

第三章人类突触小泡蛋白类似新基因hSVOP的克隆表达分析及其功能研究

3.1 hSVOP基因的克隆

3.2 hSVOP基因的全长cDNA序列结果分析

3.3 hSVOP的分子特征和进化树分析

3.4 hSVOP基因的Northern杂交和组织特异性表达

3.5 hSVOP基因的亚细胞定位结果分析

3.5.1 EGFP-N1-hSVOP重组质粒构建

3.5.2亚细胞定位分析

3.6实验结果的讨论

结语

参考文献

致谢

附录

附录1

附录2