黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析技术在中药中应用研究

摘要

黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1;AFB1）是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的黄曲霉毒素中分布最广泛、危害最大、与人类健康关系最密切、污染水平最高的一种毒素。在1993年被国际癌症研究机构（IARC）指定为第 I 类致癌物;对人类健康造成严重威胁。现如今 AFB1在食品和草药中的污染日益受到全世界的广泛关注而且许多国家和国际组织制定了相关限量标准;防止其通过食物链危害人体健康。由此针对AFB1在食品和草药中的筛查方法也逐渐被开发;但大多都需要大型仪器且操作方法复杂;在日益增多的样品检测需求和现场快速筛查需求下;无法得到普遍推广应用。因此;开发出一种能快速、准确且操作简单的AFB1筛查技术尤为重要。 本论文以胶体金免疫技术为基础;建立并完善了AFB1的胶体金免疫层析方法;并针对党参、莲子、麦芽、薏苡仁四种中药材进行检测;检测结果采用液质联用方法进行确证。研究的主要内容及相应结果如下所示： 1.胶体金和胶体金-抗体复合物的制备 本研究以柠檬酸三钠为还原剂;经一系列条件优化后制备出直径约13nm的胶体金纳米颗粒;其最佳制备条件如下：柠檬酸三钠 2.5 mL;反应沸腾时间为15 min;搅拌器转速为200转/分钟。采用紫外分光亮度法、透射电镜形貌表征和Mey氏稳定化法考察得出最佳胶体金和抗体加入量以及最优pH值调节剂的量分别为：胶体金纳米颗粒溶液6 mL;AFB1单克隆抗体6μL;以K2CO3溶液（0.1 mol/L）为pH调节剂;调节剂量为10μL。 2.黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析技术的研制 胶体金免疫试纸条采用竞争原理法;金标垫上含有一定量的金标记抗体结合物;检测线为AFB1-BSA抗原;质控线为羊抗鼠二抗。试纸条制备和应用所需优化条件如下：试纸条类型及其制备仪器的相关参数、纤维素膜的型号、样品垫和结合垫处理液以及甲醇在检测液中的相对含量。最后用优化好的胶体金免疫试纸条检测AFB1标准品溶液及其他真菌毒素标准品溶液;结果显示;试纸条稳定性良好;与其它毒素无任何交叉反应;具有较好的特异性;且灵敏度在0.1 ng/mL;可应用于中药材中AFB1的快速筛查。 3.黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析技术的应用及液质确证 建立了胶体金免疫层析技术检测党参、莲子、麦芽、薏苡仁4种中药材中的AFB1;高含量的甲醇不适用于试纸条的检测;因此样品经80%甲醇/水溶液提取后并用稀释液稀释4倍后方可应用。对实验室收集的党参9批样品、莲子6批样品、麦芽6批样品和薏苡仁4批样品分别进行试纸条检测;并用液相色谱联用质谱技术对试纸条检测结果进行验证。结果显示：莲子样品（湖南3号批次）、麦芽样品（河北批次）、薏苡仁样品（贵州批次）试纸条检测为阳性样品;其余均为阴性;所检测结果与液质联用技术确证结果一致;说明制备的胶体金免疫层析技术具有良好的准确性。 4.黄曲霉毒素B1胶体金免疫试纸条在动物药中的应用初探 建立了胶体金免疫层析技术检测蕲蛇、乌梢蛇、全蝎、水蛭4种动物药中的AFB1;检测样品经甲醇溶解;并用15%甲醇-PBS稀释后方可使用。对实验室收集的5批蕲蛇样品、6批乌梢蛇样品、4批全蝎样品和4批水蛭样品进行了试纸条检测。检测结果显示为不同批次的4种动物药样品全部显示为阴性样品。

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