人类心脏发育候选基因ZNF382和CXXC5的功能研究

摘要

人类心脏发育是一个错综复杂的过程,受一系列转录因子调控。目前虽然已经鉴定出很多心脏发育转录调控因子,但仍有很多心脏发育调控基因有待鉴定,其分子调控机制有待深入研究。ZNF382是我室克隆鉴定的一个人类心脏发育候选基因(登陆号NM032825),该基因在不同时期人类胚胎组织中广泛表达,在成人组织其表达限制在心脏,其表达特征提示ZNF382可能在心脏和肌肉发育和功能中起着潜在的调控作用。
　　本文作者继续研究ZNF382在心脏和肌肉发育中的功能。RT-PCR实验结果表明,在C2C12细胞中诱导肌细胞分化后,其内源MHC和ZNF382的mRNA水平随诱导时间的延长而上调。报告基因转录活性分析表明,ZNF382单独不能激活MCK(MCK4800-luc)的转录活性,但能够与MyoD和E12共同激活MCK的转录活性,表明ZNF382是与MyoD和E12协同调控肌细胞的分化过程。
　　为了鉴定ZNF382的相互作用蛋白,我们利用酵母双杂交技术,从成人心脏文库中筛选并鉴定出1个与ZNF382发生相互作用的蛋白MYL2。MYL2编码调控轻链相关心脏肌球蛋白β,提示ZNF382与MYL2可能共同参与心脏发育和功能的调控过程。我们首先利用亚细胞的定位实验研究ZNF382和MYL2在HEK293细胞中的定位情况。研究结果表明ZNF382定位于细胞核,MYL2在细胞核质中均有表达,当两者共同转入细胞时,MYL2蛋白大部分转移到了细胞核中,出现趋核现象,表明这两个蛋白在细胞内发生相互作用。
　　为了进一步证明ZNF382和MYL2是否发生相互作用,我们通过免疫共沉淀实验进行验证。发现MYC标记的MYL2能被FLAG标记的ZNF382沉淀,而FLAG标记的ZNF382同样可以被MYC标记的MYL2沉淀,结果表明两者在体内确实存在相互作用。前人研究结果表明,MYL2是通过钙离子触发调节轻链的磷酸化,磷酸化后的MYL2反过来又触发肌肉的收缩状态。MYL2碱基突变能导致中左心室腔心室肥厚型心肌病。ZNF382和MYL2是否共同在左心室腔心室肥厚型心肌病发生中起调控作用,将是后续研究工作的一个重点。另外,我们还克隆了一个新的人类zf-CXXC结构的锌指基因CXXC5,该基因编码322个氨基酸,在物种进化上高度保守。RT-PCR分析表明CXXC5在成人及胎儿的组织中广泛表达。CXXC5定位于细胞核和细胞质中。在细胞过表达CXXC5使导致细胞核浓缩,提示该基因可能与细胞凋亡的发生有关。
　　利用HEK293细胞系,我们首先通过流式细胞仪进一步检测CXXC5是否能促使细胞凋亡。结果表明,过表达CXXC5使细胞大量地停滞在G1前期。然后通过TUNEL法检测过表达CXXC5是否能使细胞出现细胞凋亡的表型,结果表明,瞬时过表达CXXC5的大部分细胞出现细胞凋亡的阳性结果,表明CXXC5确实与细胞凋亡的发生有关。为了研究CXXC5导致细胞凋亡的发生机制,我们利用报告基因系统和western blot研究CXXC5参与细胞凋亡的信号通路。根据细胞凋亡关键因子caspase的作用方式,细胞凋亡可分为受体途径和线粒体途径。WNF-a途径是受体途径的一种主要途径,又可分为死亡途径和促生存途径(JNK和NF-KB)。
　　研究结果表明,过度表达CXXC5抑制p53的转录活性,但激活TNF-a转录的活性。在TNF-a下游途径中,过度表达CXXC5抑制c-jun,AP-1和NF-KB的转录活性,但激活caspase-8和caspase-3转录的活性,表明CXXC5是通过激活TNF-a的caspase途径调控细胞凋亡。

目录

摘要

ABSTRACT

第一部分 人类心脏发育候选基因ZNF382

第一章 心脏发育及其相关基因

1.1 心脏发育过程

1.2 调控果蝇心脏发育的基因

1.3 调控脊椎动物心脏发育的基因

1.4 MYL2基因家族

1.5 骨骼肌发育

1.6 Zinc Finger基因家族

1.7 酵母双杂交技术

第二章 心脏发育候选基因ZNF382的功能研究

2.1 材料和方法

2.2 实验结果

第三章 总结

第四章 讨论

第二部分 人类基因CXXC5的功能研究

第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 获得CXXC5全长及生物信息学分析

2.2 RNA提取和RT-PCR

2.3 质粒的构建

2.4 RNAi的分析

2.5 TUNEL法检测细胞凋亡

2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.7 caspase-8和caspase-3酶活性测定

2.8 Western blot分析

第三章 结果

3.1 分子特性和进化保护人类CXXC5

3.2 CXXC5表达分布

3.3 CXXC5蛋白的亚细胞定位

3.4 CXXC5诱导细胞凋亡

3.5 CXXC5激活TNF-a转录的活性

3.7 CXXC5激活caspase-8和caspase-3的蛋白

第四章 讨论

参考文献

附录:中英文缩写词简表

致谢