刺糖多孢菌中两个调控基因的克隆与功能研究

摘要

本论文利用PCR扩增了刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)S08-4中700 bp的SAM-s(S-adenosylmethionine synthetase)基因和400 bp的ssgA-sp(for sporulation of Streptomyces griseus)基因，并将SAM-s基因以正确的读码框架克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a(+)T7启动子下游的NdeⅠ和BamHⅠ位点之间，转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG诱导后超量表达了25 kDa大小的重组蛋白，但以无活性的包涵体形式存在。
　　 为了进一步研究这两个重要调控基因的功能，首先需要构建一个合适的链霉菌表达载体。本研究从质粒pLSB2出发，该质粒由大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pCJR24衍生而来，它含有来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)放线紫红素(Act)生物合成基因簇的途径专一性激活基因actⅡ-ORF4，以及PactⅢ/PactⅠ双向启动子。因此在载体pLSB2的基础上，通过插入整合酶ФC31 int和attP site，构建了能在大肠杆菌和链霉菌间进行接合转移，并能整合到链霉菌染色体上的高效表达载体pMF。用pMF转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)后，分别与天蓝色链霉菌M145及其ssgA基因阻断株GSA3、变铅青链霉菌(S.lividans)TK24、红色糖多孢菌(Sacc.erythraea)2338接合，均能得到数量很多的接合子，说明构建的质粒载体pMF有着较广范围的宿主菌，都能成功整合到链霉菌的染色体上。
　　 将来自刺糖多孢菌的SAM-s基因和ssgA-sp基因通过NdeⅠ/XbaⅠ酶切位点克隆至pMF的actⅡ-ORF4/PactⅠ启动元件下游，通过接合转移转入天蓝色链霉菌M145中。对原始菌株和接合子进行固体平板培养和液体摇瓶发酵培养，并进行了抗生素含量测定和菌体形态观察，结果：(1)接合子M145/pMFsam的Act摇瓶发酵产量是对照株M145/pMF的3.2倍，而两株对照菌株M145和M145/pMF之间并没有很大差别。转接GYM和R4C平板培养，观察色素和孢子形成情况，发现转化子M145/pMFsam的孢子形成受到了明显的抑制，并且Act和Red两种色素的形成起始时间比两株对照菌都要早。(2)ssgA-sp基因能互补GSA3菌株因ssgA基因破坏所引起的缺陷表型，并且ssgA-sp的过量表达能引起变铅青链霉菌菌丝形态发生较大改变，营养菌丝无明显结团。
　　 本研究首次从刺糖多孢菌中克隆了这两个潜在的调控基因，并且在链霉菌模式菌株中进行了初步的功能研究，为后续的研究工作奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1多杀菌素及其产生菌的研究进展

1.1结构特点和理化性质

1.2杀虫活性与作用机制

1.3多杀菌素的生物合成

1.4提高多杀菌素产量

2 S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,EC2.5.1.6)研究进展

2.1腺苷甲硫氨酸合成酶简介

2.2链霉菌属腺苷甲硫氨酸合成酶研究进展

3细胞分裂激活因子SsgA的研究进展

3.1 SsgA类蛋白只存在于形态复杂的放线菌中

3.2 SALPs的功能

3.3 ssgA基因的转录和翻译调控

3.4 SsgA在工业发酵中的应用

4立题依据和意义

第二章材料与方法

1.材料

1.1供试菌株

1.2培养基

1.3抗生素及其使用浓度

1.4工具酶及抗体

1.5试剂盒

1.6 PCR引物及产物测序

1.7常用溶液和缓冲液

1.8主要仪器设备

2研究方法

2.1菌种培养及保藏

2.2刺糖多孢菌基因组DNA的提取

2.3大肠杆菌质粒DNA的小量提取

2.4 PCR扩增

2.5 DNA的连接

2.6大肠杆菌感受态细胞制备

2.7大肠杆菌的转化

2.8转化子的快速筛选

2.9重组子的酶切鉴定

2.10 SAM-s和ssgA基因的生物信息学分析

2.1l SAM-s基因大肠杆菌表达载体的构建

2.12 IPTG诱导大肠杆菌中重组基因的表达

2.13大肠杆菌-链霉菌穿梭表达载体pMF的构建

2.14 SAM-s和ssgA-sp基因链霉菌表达载体的构建

2.15大肠杆菌与链霉菌之间的属间接合转移

2.16 Southern blotting

2.17链霉菌细胞蛋白抽提物的制备

2.18发酵培养

2.19菌丝生长和抗生素形成情况的测定

2.20链霉菌的形态观察

第三章结果与分析

1刺糖多孢菌SAM-s和ssgA-sp基因的克隆

2 SAM-s和SsgA蛋白的生物信息学分析

2.1基本参数

2.2二级结构的预测

3大肠杆菌-链霉菌穿梭整合型载体pMF的构建

4 pMF在大肠杆菌与链霉菌属间接合转移及在染色体上的整合

5 SAM-s基因的功能研究

5.1 SAM-s基因在大肠杆菌中的表达

5.2 SAM-s基因在链霉菌中的表达

6 ssgA-sp基因的功能研究

6.1 ssgA-sp基因在天蓝色链霉菌ssgA阻断菌株GSA3中的表达

6.2 ssgA-sp基因在变铅青链霉菌中的表达

讨论

主要结论和今后的研究设想

参考文献

致 谢

攻读硕士学位期间撰写和发表的论文