基于聚合物固定生物识别分子和纳米增敏新法的安培生物传感研究

摘要

生物传感分析是将生物活性材料(酶、抗体/抗原、核酸、适体等)的分子识别功能与物理化学传感换能技术有机结合的现代分析化学分支，具有灵敏度高、选择性好、操作便利、分析速度快、成本低、易于实现实时监测等特点，在复杂环境乃至活体分析中也不乏其应用实例。自第一支生物传感器在20世纪60年代诞生以来，生物传感分析领域发展迅速，备受学术界和产业界关注。有效固定生物识别材料是研制生物传感器的关键步骤之一，采用化学聚合法或电化学聚合法制备生物兼容性聚合物生物敏感材料一直是固定生物识别分子的重要方法。近年来，随着纳米科技的蓬勃发展，纳米生物传感迅速成为生物传感分析领域的国际前沿和热点。本学位论文中，我们简要综述了电化学生物传感器的近期进展，以及聚合物和纳米材料在生物传感领域的应用，并针对基于聚合物固定生物识别分子和纳米增敏新法的生物传感分析开展了系列研究工作，主要内容如下：
　　 ⑴将化学/电化学聚合法有机结合，提出了在含酶和单体悬浊液/水溶液中一锅法化学预氧化-电聚合单体(CPEM)的新方法用于高效固定酶，藉此研制了高敏安培生物传感器。考察了1，4-苯二硫酚(BDT)、1，6-已二硫醇(HDT)、邻苯二胺、邻氨基酚和吡咯等单体；铁氰化钾和对苯醌两种预氧化剂；葡萄糖氧化酶(GOx)和碱性磷酸酶两种酶及其生物传感器。代表性实验步骤如下：在BDT单体和酶的水相悬浊液中加入预氧化剂K3Fe(CN)6引发化学氧化聚合，得到包埋有大量高活性酶分子的BDT寡聚体-酶复合物，再电氧化聚合该复合物和BDT单体，最终制得高性能酶膜。与常规电聚合法(CEP)相比，CPEM法所制葡萄糖安培生物传感器的灵敏度提高至32.4倍。通过电化学石英晶体微天平(EQCM)和紫外-可见光谱法的定量测试，发现采用CPEM法可显著提高酶膜中酶的负载量和比活性。
　　 ⑵以酶生H2O2(EG-H2O2)为预氧化剂，提出了高效固定酶的一锅法生化预氧化-电聚合单体(BPEM)新方法，藉此研制了高敏葡萄糖安培生物传感器。基本实验步骤如下：在含GOx和2,5-二巯基-1，3，4-噻二唑(DMcT)的水相悬浊液中加入葡萄糖，酶生H2O2使DMcT氧化聚合，生成DMcT寡聚体-GOx复合物，再电氧化聚合该复合物和DMcT单体，可在电极表面制得高性能酶膜。与CEP法比，该法所制传感器的灵敏度提高至119倍，检测下限降低了2个数量级。发现BPEM法所制酶电极的灵敏度比基于外加H2O2的CPEM法更高，原因可能为生化预氧化聚合/包埋作用主要发生在酶分子附近(反应临近性)，故酶负载量更大。采用EQCM监测了电极修饰过程，发现DMcT聚合膜可被电还原而从电极上脱落，这有利于电极基底的电化学再生。
　　 ⑶采用多巴胺(DA)为单体、HAuCl4或H2PtCl6为预氧化剂，通过CPEM法固定GOx和半乳糖氧化酶，制备了新型聚合物生物纳米复合物(PBNCs)：聚多巴胺(PDA)-酶-纳米金(或铂)(AuNPs或PtNPs)复合物，籍此研制了高敏葡萄糖和半乳糖安培生物传感器。PDA基质具有优异的吸附性能和生物相容性，有利于高效固定酶和纳米增敏。与CEP法相比，基于该PBNCs的酶电极更灵敏，金和镀铂金电极上对葡萄糖的检测灵敏度分别达99和129μA cm-2 mmol-1L。基于PBNCs的第二代安培传感器亦有优异性能。
　　 ⑷提出了化学氧化聚合-磁性分离/固定新方法用于高效固定酶，藉此研制了高敏葡萄糖安培生物传感器。先采用化学共沉淀法合成了Fe3O4@Au核壳型磁性复合纳米粒子，然后据化学氧化聚合法制得聚1，6-已二硫醇(PHDT)-GOx-Fe3O4@Au纳米复合物，并借助磁场将该复合物分离/固定在磁性电极表面。所制酶电极对葡萄糖的检测灵敏度达110μA cm-2 mmol-1 L，检测限为0.3μmol L-1。该法简便、省时、高效。
　　 ⑸提出采用新型HDT电聚合膜固定AuNPs、实现纳米增敏压电免疫传感的新方法。通过EQCM等技术研究了HDT电聚合过程和机理。结合理论分析和实验结果，定量考察了AuNPs在HDT电聚合膜上的覆盖度和纳米增敏效应。比较研究了羊抗人免疫球蛋白G(anti-hIgG)的吸附，及后续的与人免疫球蛋白G(hIgG)的免疫反应。与常规HDT自组装单层修饰电极相比，基于HDT电聚合膜的修饰电极可更有效地固定抗体、性能更稳定、制备时间更短。新型硫醇聚合膜材料有望作为硫醇自组装单层的有益补充而在生物传感研究中广泛应用。
　　 ⑹基于化学氧化聚合法制备了免疫PBNCs：PDA-PtNPs-anti-hIgG复合物，该复合物免疫亲合性高并可高效催化H2O2电还原，籍此研制了高敏三明治型安培免疫传感器。该传感器可检测低至0.018 ngmL-1的hIgG，具有良好的重现性、稳定性、再生性和特异性，可用于临床人血清样品中目标物检测。
　　 ⑺基于化学氧化法制备了PDA-PtNPs-GOx纳米复合物，然后借助葡萄糖存在下酶生H2O2生化还原HAuCl4，在纳米复合物表面原位生成AuNPs用于高效吸附固定抗体及酶标GOx，制得GOxads/anti-hIgG/AuNPs/PDA-PtNPs-GOx生物纳米复合物，籍此研制了高敏三明治型电化学免疫传感器。该法优势在于能在该生物纳米复合物表面和内部均高效固定GOx酶标，有效地提高了酶标的负载量及活性。以醌/氢醌为媒介体，实现了超敏免疫信号的输出，所制免疫传感器可检测低至2 pg mL-1的hIgG。
　　 ⑻将AuNPs/PDA-PtNPs-GOx纳米复合物滴干修饰于金电极表面，共价固定巯基化适体以特异结合凝血酶，以GOx标记物的催化电流为信号输出，研制了“信号衰减”型电化学适体传感器。凝血酶与适体结合后产生传质阻力，可显著抑制标记酶的催化反应速度，降低酶生H2O2氧化电流。所制适体传感器可检测低至0.1 nmolL-1的凝血酶。
　　 ⑼结合磁分离/富集技术，提出了以适体缠绕的单壁碳纳米管(SWCNTs)为放大平台的新型三明治型适体安培传感器。以凝血酶适体Ⅰ修饰的磁性纳米粒子、凝血酶、凝血酶适体Ⅱ缠绕的SWCNTs构建三明治型复合物，借助磁场将其分离并富集至磁性金电极上，通过亚甲基蓝分子对SWCNTs上缠绕的适体Ⅱ的位置取代作用，成功分离得到亚甲基蓝/SWCNTs修饰的金电极。以亚甲基蓝的脉冲伏安峰电流为分析信号，所制适体传感器可检测低至3 pmol L-1的凝血酶，优于其它类似传感器。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章　绪论

1.1电化学生物传感器

1.1.1生物传感器概述

1.1.2电流型酶生物传感器

1.1.3电化学免疫生物传感器

1.1.4电流型适体生物传感器

1.2生物识别分子的固定及传感增敏

1.2.1聚合物用于生物识别分子固定与传感器增敏

1.2.2纳米材料用于生物识别分子固定与传感器增敏

1.3本文构思

第二章化学预氧化结合电聚合法固定酶研制高敏生物传感器

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1仪器与试剂

2.2.2实验步骤

2.2.3酶活性评估

2.3结果与讨论

2.3.1酶电极制备与表征

2.3.2酶电极制备条件优化及其性能

2.3.3 EQCM法及紫外—可见光谱法评估酶活性

2.3.4 CPEM法的通用性

2.3.5机理简要讨论

2.4小结

第三章生物化学预氧化-电聚合一锅法研制高敏葡萄糖传感器

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1仪器与试剂

3.2.2酶电极构建及表征

3.2.3安培检测

3.3结果与讨论

3.3.1中性水相悬浊液中DMcT电聚合

3.3.2酶电极制备及表征

3.3.3条件优化

3.3.4酶电极性能

3.4小结

第四章 聚合物-酶-金属纳米复合膜用于高敏生物传感

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1仪器与试剂

4.2.2实验步骤

4.3结果与讨论

4.3.1 PBNCs膜的制备与表征

4.3.2 PBNCs酶电极性能

4.3.3 ESA评估及对PBNCs的纳米增强效应的探讨

4.3.4第二代传感器

4.4小结

第五章聚合物-磁性纳米粒子复合膜用于高敏葡萄糖安培传感

5.1引言

5.2实验部分

5.2.1仪器和试剂

5.2.2 MPBNCs制备及表征

5.2.3酶电极制备及表征

5.2.4安培检测

5.3结果与讨论

5.3.1 MPBNCs表征及传感器条件优化

5.3.2生物传感器的性能

5.4小结

第六章二硫醇电聚合膜固定金纳米粒子用于压电免疫传感

6.1引言

6.2实验部分

6.2.1仪器与试剂

6.2.2实验步骤

6.3结果与讨论

6.3.1 HDT自组装及PHDT的电合成与表征

6.3.2纳米增敏效应的理论及实验探讨

6.3.3抗体吸附及免疫反应

6.4小结

第七章铂纳米粒子纳米复合物用于超灵敏免疫分析

7.1引言

7.2实验部分

7.2.1仪器和试剂

7.2.2不同PBNCs的制备

7.2.3生物传感器的制备与表征

7.2.4免疫检测

7.3结果和讨论

7.3.1不同PBNCs的制备和表征

7.3.2免疫检测

7.4小结

第八章酶标记聚合物纳米复合物用于高性能电化学免疫分析

8.1引言

8.2实验部分

8.2.1仪器和试剂

8.2.2 PBNCs的制备

8.2.3免疫传感器制备与表征

8.2.4免疫测定

8.3结果与讨论

8.3.1 AuNPs／PDA-PtNPs-GOx制备及表征

8.3.2 PBNCs 1的制备与表征

8.3.3免疫测定

8.4小结

第九章基于聚合物基生物纳米复合材料的电化学适体传感器

9.1引言

9.2实验部分

9.2.1仪器和试剂

9.2.2实验步骤

9.3结果与讨论

9.3.1 PDA-GOx-AuNPs纳米复合物的制备和表征

9.3.2传感器构建与表征

9.3.3适体传感器性能

9.4小结

第十章 基于适体缠绕的单壁碳纳米管的高敏电化学适体传感

10.1引言

10.2实验部分

10.2.1仪器与试剂

10.2.2实验步骤

10.3结果与讨论

10.3.1适体Ⅰ＠MNPs及适体Ⅱ＠SWCNTs对凝血酶的亲合能力

10.3.2 MB在适体Ⅱ＠SWCNTs表面的竞争吸附作用

10.3.3传感器性能

10.4.小结

参考文献

附录

致谢