不同持续时间低氧后运动对大鼠胸腺组织细胞凋亡的影响

摘要

目的:本研究采用不同持续时间低氧暴露后大鼠进行常氧下中等强度运动模型(模拟高住低练),探讨不同持续时间低氧暴露后运动条件下,观察大鼠胸腺组织细胞形态变化、细胞凋亡小体数目、胸腺组织分泌的胸腺素及CD30含量的变化、凋亡通路及相关因子蛋白及mRNA表达的影响,揭示不同持续时间低氧后运动对胸腺细胞凋亡的影响及其可能作用机制。
　　 方法:60只SD大鼠按体重随机分为6组(10只/组),即:正常对照组(A)、低氧暴露8h组(B)、低氧暴露12h组(C)、常氧运动组(D)、低氧8h暴露后运动组(E)和低氧12h暴露后运动组(F)。D、E、F组大鼠在坡度为0,速度为25m/min的PT动物跑台上每天运动1h。运动完后,将B、E组和C、F组依次放入氧浓度为12.5％(相当于海拔4000m)的低氧舱内8h和12h,共持续4周(5天/周)。最后一次实验结束后24小时,大鼠腹腔麻醉断头处死,取胸腺组织液氮保存,胸腺组织匀浆后酶联免疫(ELISA)法检测胸腺组织胸腺素、CD30的水平;制备胸腺组织石蜡切片,常规HE染色检测胸腺组织细胞形态学的变化;TUNEL标记法在光镜下观察胸腺组织凋亡;免疫组化法检测大鼠胸腺组织细胞HIF-1a、B细胞淋巴瘤/白血病癌基因-2(B celllymphoma/leukemia2,Bcl-2)、Bax(Bel-2 associated x,Bax)因子的蛋白水平;RT-PCR法检测大鼠胸腺细胞HIF-1a、Bcl-2、Bax的mRNA水平。
　　 结果:(1)组织匀浆胸腺素、CD30含量变化:胸腺素、CD30含量A组、B组、C组三组之间比较均显示,具有显著性差异(p＜0.05),两两比较A组胸腺素、CD30的含量达均低于B组和C组,C组高于B组,具有显著性差异(p＜0.05);E组、F组、D组三组比较,胸腺素与CD30均无显著性差异(p＞0.05),但E组和F组较D组有上升的趋势;D组、E组、F组胸腺素、CD30含量分别高于A组、B组、C组,具有显著性差异(P＜0.05)。
　　 (2)HE染色显示:A组胸腺组织细胞结构完整,胞核较大,核膜完整。髓质与皮质部未见特殊改变;B组胸腺细胞较A组胸腺细胞无明显的变化,在皮质部分出现少量的脱落细胞;C组胸腺小体部分细胞肿胀,核膜部分边缘脱落,在皮质可见较多的脱落细胞;D组胸腺小体部分扩大,细胞呈扁平,细胞间隙增大;E组胸腺小体扩大,胸腺小体细胞轻度肿胀,少量核膜有轻度损坏未见脱落;F组胸腺细胞水肿,以皮质部最为严重,在皮质部可见到细胞核损坏的脱落细胞。
　　 (3)TUNEL染色显示:胸腺细胞凋亡阳性颗粒多发生在皮质和髓质,少发生在胸腺小体部分。图像分析表明E组、F组、D组三组凋亡指数之间比较,呈显著性差异(p＜0.05),两两比较F组阳性凋亡均高于D组和E组,E组高于D组,具有显著性差异(p＜0.05);D组、E组、F组凋亡指数分别高于A组、B组、C组,具有显著性差异(P＜0.05)。
　　 (4)免疫组织化学染色石蜡切片观察大鼠胸腺组织HIF-1a,的蛋白表达显示:HIF-1a免疫组织化学阳性物质定位于胞浆内,细胞核内偶见,核膜阴性,呈弥散或颗粒状主要分布于胸腺组织皮质部分。统计学分析结果显示:A组、B组、C组三组之间比较,具有显著性差异(p＜0.05),两两比较B组和C组表达均高于A组比较,均具有显著性差异(p＜0.05);E组、F组、D组三组比较,具有显著性差异(p＜0.05);两两比较F组均高于D组和E组,E组低于D组,均具有显著性差异(p＜0.05);D组、E组、F组阳性表达分别高于A组、B组、C组,具有显著性差异(P＜0.05)。
　　 (5)免疫组化染色石蜡切片观察大鼠胸腺组织Bcl-2、Bax的阳性表达显示:bcl-2、Bax免疫组织化学阳性物质定位于胞浆内,偶见细胞核内,核膜阴性,呈弥散或颗粒状主要分布于胸腺组织皮质部分。统计学分析结果:Bcl-2、bax的阳性表达均显示A组、B组、C组三组之间比较,具有显著性差异(p＜0.05),两两比较A组阳性表达均低于B组和C组,C组高于B组,具有显著性差异(p＜0.05);D组、E组、F组阳性表达分别高于A组、B组、C组,具有显著性差异(P＜0.05)。
　　 (6)大鼠胸腺组织细胞凋亡与Bax、Bax/bcl-2比值的相关性以及HIF-1a与Bax表达的相关性显示:大鼠胸腺组织细胞凋亡指数与Bax、Bax/Bcl-2比值之间存在正相关(p＜0.05);胸腺组织细胞HIF-1a的蛋白表达与Bax之间存在正相关(P＜0.05)。
　　 (7)RT-PCR检测mRNA的表达:Bcl-2、bax mRNA表达A组、B组、C组三组之间比较,具有显著性差异(p＜0.05),两两比较A组mRNA表达均低于B组和C组,C组高于B组,具有显著性差异(p＜0.05);D组、E组、F组mRNA表达分别高于A组、B组、C组,具有显著性差异(P＜0.05);HIF-1a mRNA表达A组、B组、C组三组之间比较,具有显著性差异(p＜0.05),两两比较B组和C组表达均高于A组比较,均具有显著性差异(p＜0.05);D组、E组、F组mRNA表达分别高于A组、B组、C组,具有显著性差异(P＜0.05)。
　　 结论:1.低氧暴露或运动促进胸腺组织浆液胸腺素和CD30的含量升高,但低氧暴露后运动双重刺激下其含量没有变化。
　　 2.低氧暴露或低氧暴露后运动诱导胸腺组织凋亡,凋亡多发生在皮质和髓质,胸腺小体少见,且低氧暴露8h作为应激原作用强度较缓和。
　　 3.低氧暴露后运动诱导胸腺凋亡因子Bax、bcl-2蛋白表达以及Bax/bcl-2比值均升高,且mRNA与蛋白的表达一致。
　　 4.低氧暴露后运动诱导HIF-1a的蛋白表达升高,但mRNA的表达与蛋白表达不一致。
　　 5.Bax与bcl-2参与胸腺细胞凋亡的调控,且HIF-1a可能协同bcl-2家族参与凋亡调控。随着低氧时间的延长,促凋亡因子Bax的表达加速,加快胸腺细胞凋亡。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要试剂与仪器

2.2.1 主要试剂

2.2.2 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 实验分组

2.3.2 切片标本制备

2.3.3 组织匀浆及ELISA测定

2.3.4 HE染色

2.3.5 TLINEL染色

2.3.6 免疫组织化学染色

2.3.7 胸腺组织总RNA提取

2.3.8 RT-PCR反应

2.4 质量控制

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 大鼠胸腺细胞形态学的变化

3.2 组织匀浆胸腺素、CD30含量

3.3 大鼠胸腺细胞TUNEL法凋亡检测

3.3.1 显微图像结果

3.3.2 凋亡发生率

3.3.3 凋亡指数

3.4 凋亡信号通路相关因子蛋白表达

3.4.1 免疫组化图像观察

3.4.2 Bcl-2、bax、HIF-1a蛋白阳性表达

3.5 凋亡信号通路相关因子mRNA表达

3.6 凋亡指数与凋亡信号相关因子表达的相关程度

4 讨论

4.1 低氧运动对胸腺形态结构的影响

4.2 低氧运动对胸腺分泌的激素及激素类物质的影响

4.3 低氧运动对凋亡相关因子Bax、bcl-2蛋白及mRNA表达的影响

4.4 低氧运动对HIF-1a蛋白及mRNA表达的影响

5 结论

参考文献

文献综述:低氧运动与胸腺细胞凋亡

论文说明:缩略词表

后记