miRNA与水稻种子活力的相关性研究

摘要

miRNA(microRNA)是一类真核生物细胞中广泛存在的内源性非编码的单链小分子RNA,大小为19～25 nt。越来越多的研究发现,miRNA是真核生物体内基因表达的重要调节因子。
　　 本文以常规水稻ZR02为材料,试图探讨miRNA表达与种子活力的相互关系。首先采用人工老化处理,得到不同活力水平的种子,然后通过miRNA芯片比较分析了四个不同活力水平的种子胚中miRNA的表达差异,并通过荧光定量PCR技术对差异表达的miRNA进行了验证分析,进一步通过生物信息学的方法,初步分析了这些差异表达miRNA的靶基因及其功能。主要结果如下:
　　 1.随着人工老化处理时间的延长,种子活力逐渐下降,种子活力的重要指标一萌发率在老化处理12 d时降低到75％左右,此后下降速率明显加快,老化至第22 d时种子丧失萌发能力(萌发率为O)。
　　 2.通过miRNA芯片比较分析了人工老化至不同活力水平的种胚中miRNA的差异表达。结果表明,随着种子活力降低,miRNA的表达模式可分为以下四种情况:(1)表达逐步下调,如miR160和miR444a.2/miR444d.2/miR444e；(2)表达逐步上调,如miR817、miR399j等；(3)交替上、下调表达,相比于未老化种子,表达总体水平上调,如miR395t、miR164c等；(4)交替上、下调表达,相比于未老化种子,表达总体水平下调,如miR164e、miR167(a-j)。
　　 3.通过实时定量PCR进一步验证芯片分析获得的20个表达差异明显的miRNA,结果表明,miR817、miR399j、miR399d、miR395t、miR164c、miR168a等6个的表达量变化与芯片结果较为一致。
　　 4.同源miRNA成熟序列的保守性与其在不同活力种胚中的表达量变化的相关性分析表明,成熟序列保守性高的同源miRNAs在不同活力种胚中的表达量的变化规律较为相似,保守性较低的同源miRNAs表达差异较大。
　　 5.通过生物信息学的方法预测这些差异性表达miRNA的靶基因及其可能的功能时,发现它们与一些膜蛋白、ATP合成酶等的表达有关。因为种子老化过程中细胞代谢活动必然牵涉到膜蛋白和参与生理生化代谢的酶的活性变化,因此推测miRNA的表达变化可能参与种子活力相关的代谢活动的调控。

目录

文摘

英文文摘

1 文献综述

1.1 miRNA的研究概况

1.1.1 miRNA的发现

1.1.2 miRNA的生物学特征

1.1.3 miRNA与siRNA的比较

1.1.4 miRNA的命名与鉴定

1.1.5 miRNA的生物发生

1.1.6 植物中miRNA的生物学功能及意义

1.1.7 miRNA的作用机制

1.1.8 分离、鉴定miRNA的方法

1.1.9 miRNA靶基因的预测及其生物学验证

1.1.10 miRNA的生物学功能鉴定

1.2 种子老化机理的研究进展

1.2.1 老化种子的生理生化变化

1.2.2 老化种子的遗传结构变化

1.3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验器材

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 主要试剂

2.1.4 生物信息学分析的主要软件与数据库

2.2 方法

2.2.1 种子的人工老化处理

2.2.2 种子萌发率的测定

2.2.3 miRNA芯片分析

2.2.4 RNA的提取

2.2.5 miRNA逆转录反应

2.2.6 Real-time PCR

2.2.7 生物信息学分析

2.3 结果整理与分析

3 结果与分析

3.1 人工老化条件下种子的活力变化

3.2 不同活力种子胚中miRNA表达量的芯片分析

3.2.1 芯片扫描结果分析

3.2.2 miRNA表达量的差异分析

3.3 不同活力种子胚中差异表达miRNA的实时定量PCR分析

3.3.1 用于RTqPCR分析的种子活力检测

3.3.2 内参5.8S RNA在不同样本中的数据分析

3.3.3 RTqPCR结果与芯片结果的比较

3.4 随种子活力变化呈差异表达的miRNA的生物信息学分析

3.4.1 miRNA成熟序列的保守性比较

3.4.2 miRNA的靶基因及其功能的预测分析

4 讨论

4.1 人工老化条件下水稻种子活力的变化

4.2 同源miRNA表达量的变化与其成熟序列保守性之间的关系

4.3 miRNA与水稻种子活力的关系

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

致谢