壳聚糖固定化血管紧张素转化酶的制备及其应用

摘要

血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)在肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system)和激肽释放酶-激肽系统(Kallilrein-kinin system)中起着重要的作用。其能催化水解血管紧张素Ⅰ转化为具有强升压作用的血管紧张素Ⅱ，同时也能使血管活性多肽缓激肽失活，从而导致血压升高。抑制ACE的活性对降低血压有着积极的作用。目前，ACE抑制剂(ACEI)已成为治疗高血压的重要药物。但合成ACEI副作用较大，因此，近年来的研究都致力于开发新型、低毒副作用、安全天然的ACEI，并将ACEI的来源锁定于各种食物、动物、植物、中药等。其中，中药治疗高血压的有效性毋容置疑，目前已有70多种中药被用于治疗高血压，中药已成为一个重要的ACEI库，潜隐于其中的新型ACEI有待发现。但中药成分复杂，ACEI快速筛选方法的建立及优化是研发新型降压药物的关键与难点。
　　 深入了解ACE的理化性质，测定ACE体外活性及抑制活性等研究中需要使用大量的ACE，但ACE纯化过程复杂，商品化ACE价格昂贵，且游离ACE容易失活难以贮存。选用合适的方法将ACE固定于适宜载体上，能在保持ACE催化特性的同时，有效提高ACE的稳定性及重复利用率。另外，固定化完成后，还可以通过对其进行进一步的物理、化学处理，用以改进固定化ACE的活力及稳定性。得到的性能良好的固定化ACE，可作为亲和吸附介质或亲和色谱填料用于ACEI的高通量快速筛选。
　　 本文就ACE固定化方法及固定化载体制备，固定化ACE的活性调节及在ACEI筛选中的应用、复杂体系ACE抑制活性快速检测方法、中药复方和单味中药对ACE抑制活性及相互关系等方面做了以下的研究：
　　 (1)分别使用交联、吸附的方法将ACE固定于交联壳聚糖珠(CCB)及胺处理交联壳聚糖珠(MCB)上，比较了不同固定化方法对固定化ACE比活力及活性表现率的影响。考察了交联壳聚糖珠固定化ACE(CCB-ACE)及胺处理交联壳聚糖珠固定化ACE(MCB-ACE)的最适酶促反应pH及温度、Km、Vmax、稳定性及重复利用性等性质。结果表明：MCB-ACE的比活力、活力表现率、pH稳定性、热稳定性、重复利用性及贮存稳定性均优于CCB-ACE；但由于吸附固定化的作用力较弱，MCB-ACE上的酶较CCB-ACE更易泄漏，但泄漏量低。综合来看，以吸附法将ACE固定于MCB上是固定化ACE的一种较好的可行方法。
　　 (2)以戊二醛交联壳聚糖珠为载体制备固定化ACE(CCB-ACE)，CCB-ACE的活性及稳定性虽低于MCB-ACE，但载体与酶结合的更牢固。本章将烷基胺(甲胺、乙胺、正丁胺、二乙胺、三乙胺)作为载体表面残余醛基的淬灭剂，对CCB-ACE进行“后处理”，以此来改善CCB-ACE的活性及稳定性。实验对烷基胺的“后处理”条件进行了优化，比较了处理前、后CCB-ACE的活性、酶动力学参数、最适pH及温度、pH稳定性、热稳定性、重复利用性及贮存稳定性等性质。结果表明，在最佳条件下，经2240mM甲胺处理后，CCB-ACE的活性增大了2-4倍；载体表面残余醛基淬灭后，载体表面呈惰性，改善了固定化ACE所处微环境，从而CCB-ACE稳定性也得到了很大提高；处理后的CCB-ACE的表观米氏常数Km从4.33mM降至2.61mM，证明处理后CCB-ACE与底物亲和力也得以增强。
　　 (3)在前一章中烷基胺已被证实能通过淬灭CCB-ACE载体表面的残余醛基有效提高CCB-ACE的活性及稳定性。当CCB-ACE作为亲和介质时，载体表面上的残余醛基亦会引起非特异性吸附，从而导致抑制剂筛选中的假阳性结果。文章中将烷基胺作为非特异性吸附屏蔽剂，结合高效液相色谱方法考察了多种ACEI(卡托普利、赖诺普利、贝拉普利、培哚普利、福辛普利)在烷基胺处理前、后的CCB-ACE上的特异性及非特异性吸附情况，将中药青兰中的多种核苷成分作为筛选模型验证了烷基胺对非特异性吸附的屏蔽效果。以甲胺处理后的CCB-ACE作为亲和吸附介质，使用“差异筛选”法从山楂提取物中筛选ACEI；结合筛选结果指认了两种具有ACE抑制活性的成分，分别为绿原酸、表儿茶素。两者对ACE的IC50分别为2.98mM、7.65mM。这种使用固定化ACE对中药复杂体系进行亲和筛选的方法具有简便、快速、高效、低消耗等优点。烷基胺能有效屏蔽由载体表面残余醛基引起的非特异性吸附，保证了筛选结果的准确性。
　　 (4)建立在线亲和色谱法快速筛选ACEI系统的核心是制备高性能的固定化ACE酶柱。“整体式”酶柱与颗粒填充酶柱相比，具有柱床更均一，表面积更大等优点。本章利用壳聚糖酸溶碱不溶的原理，直接凝结法制备“整体式”壳聚糖柱；并利用冻凝胶法制备“整体式”壳聚糖柱及卵蛋白/壳聚糖柱。实验优化了三种“整体式”材料的制备条件，对其结构及性能进行了表征、比较。将“整体式”卵蛋白/壳聚糖柱作为载体用于ACE固定化，优化了固定化条件，并对固定化ACE的活性、最适酶促反应pH及温度、Km、Vmax、稳定性及重复利用性等相关性质进行了考察。结果证明，以冻凝胶法制备的“整体式”卵蛋白/壳聚糖柱是一种良好的ACE固定化载体，其易于制备，具有渗透性好、高传质速率、高容量、易装填等优点，得到的固定化ACE比活力高。为建立在线亲和色谱快速筛选ACEI的方法奠定了基础。
　　 (5)本文在传统ACE体外活性测定方法的基础上，以猪肺ACE粗提物为酶源，马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)为底物，使用溶剂诱导相变萃取法(Solvent induced phase separation extraction，SIPSE)萃取酶反应产物马尿酸(HA)，紫外分光光度法(UV)测定HA生成量，以评估ACE活性及样品对ACE的抑制活性。以卡托普利为模型对本方法进行了验证，并将本方法与传统的乙酸乙酯萃取及HPLC法进行了对比，测定了几种蔬菜汁及多种中药提取物对ACE的抑制活性。结果表明，猪肺ACE粗提物即可满足ACE抑制活性测定的需要；与传统液液萃取法相比，SIPSE对HA具有更高选择性及萃取能力，萃取率为97.47±0.55％(n=3)；通过计算校正，扣除基质及干扰成分对UV法测定的影响，SIPSE-UV法能用于测定成分复杂体系对ACE的抑制活性。
　　 (6)基于前一章建立的SIPSE-UV体外ACE抑制活性测定方法，测定了复方“天麻钩藤饮”及组成其的11种单味药的煎煮液对ACE的抑制活性。分析了复方及11种单味药的HPLC-UV指纹谱图差异。评估了11种单味药对复方ACE活性的贡献率，探讨了复方与各单味药间的相互作用。评估中药对ACE抑制率及复方单味药对总抑制率的“贡献”大小，可以从抑制ACE活性的角度探讨中药的降压机理，为开发新型天然ACEI类降压药物奠定基础，还能为中药的质量控制提供重要信息。