一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其杀虫活性的研究

摘要

鳞翅目（Lepidoptera）是一种世界性危害广的害虫，每年给全球造成上亿美元的损失。因此深入挖掘丰富的菌株资源，筛选具有广谱高效杀虫毒力的菌株，对构建广谱高效工程菌、研制环保微生物杀虫剂具有重要的理论及实践意义。
　　本论文以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌为研究对象，通过菌落形态观察、光学显微镜、激光共聚焦显微镜等进行镜检菌体形态以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定，该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis，命名为HX08，并将其16S rRNA基因序列提交上Genbank数据库，获得了登陆号KF774302。
　　同时，从该菌株的生理生化特性方面进行了验证，如革兰染色实验、柠檬酸盐利用、明胶液化、吲哚实验、甲基红实验、V.P实验、卵磷脂酶实验、淀粉水解实验、纤维素水解实验、L-阿拉伯糖水解实验、D-葡萄糖水解实验、D-木糖水解实验等。并对该菌株的生长特性进行了一系列初步研究，包括生长曲线、最适pH值、培养过程中pH值变化情况及抗生素抗性等。
　　研究了该菌株发酵不同时期下不同浓度的样品对棉铃虫幼虫(Helicoverpa armigera)的杀虫活性及致死毒力，结果发现，HX08菌株在60h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好。通过对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿杆菌、产气肠杆菌等多种病原细菌进行抑菌实验，发现该菌株在60h发酵时间段对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌菌株的抑菌效果最明显。
　　对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行了初步研究，建立了HPLC技术分离体系，使用H2O做流动相，以0.5mL/min流速洗脱，检测波长分别为215nm、254 nm和280 nm，收集第15mL收集管处即保留时间为31 min的2号峰粗分离物活性较高。并切取SDS-PAGE胶目的蛋白质条带酶解，利用质谱(LTQ-MS)技术进行了分子特性分析，鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶。
　　本研究为丰富枯草芽胞杆菌菌种资源，挖掘微生物活性产物基因资源，进一步研究该菌的杀虫和抗菌活性物质奠定了重要基础。

目录

摘要

中英文对照缩略表

第一章 前言

1．1 芽胞杆菌的研究与应用

1．2 枯草芽胞杆菌研究进展

1．2．1 枯草芽胞杆菌的研究现状

1．2．2 枯草芽胞杆菌的广泛应用

1．2．3 枯草芽胞杆菌的代谢物质

1．2．4 草酸脱羧酶的性质及应用

1．3 立题依据和现实意义

1．4 本研究的设计

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 培养基

2．1．2 抗生素

2．1．3 供试昆虫

2．1．4 供试病原菌

2．1．5 酶和试剂

2．1．6 常用溶液和缓冲液

2．1．7 实验仪器和设备

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的筛选分离和纯化

2．2．2 生理生化分析和菌株分类鉴定

2．2．3 HX08菌株生长特测定

2．2．4 HX08菌株生物活性的测定

2．2．5 HX08菌株活性物质的初步纯化分析

第三章 结果和分析

3．1 枯草芽胞杆菌新菌株HX08的分离纯化

3．2 HX08菌株鉴定

3．2．1 菌株形态

3．2．2 生理生化鉴定

3．2．3 HX08菌株16S rRNA基因同源性分析

3．3 HX08菌株的生长特性测定

3．3．1 生长曲线测定

3．3．2 培养过程中pH值变化情况与生长最适pH值

3．3．3 实验室常用抗生素抗性鉴定

3．4 HX08菌株生物活性测定

3．4．1 杀虫活性分析

3．4．2 抑菌效果分析

3．5 活性物质初步分离和纯化

3．5．1 HX08菌株全蛋白SDS-PAGE比对

3．5．2 HX08菌株活性物质HPLC分离体系

3．5．3 HX08菌株活性蛋白质质谱分析

第四章 小结与讨论

参考文献

硕士期间撰写和发表的与本课题相关的学术论文

致谢

声明