PKC或PKA诱导Talin高化学计算磷酸化反向调控Calpain介导蛋白裂解和细胞迁移

摘要

粘附斑是一个由180多种蛋白组成的蛋白复合物，向外能连接ECM，向内则与肌动蛋白细胞骨架以及潜在的细胞迁移信号级联网络进行连接。在粘附斑的转换的过程中，Talin因为它的calpain酶切位点介导的蛋白裂解作用而对粘附斑解聚起至关重要的作用，但调控机制还未得到很好的阐明。现在我们证明:由PKC或PKA诱导的talin头部三个高化学计算磷酸化位点磷酸化反向调控Calpain介导的蛋白裂解和细胞迁移。定点突变封闭高化学计算磷酸化，导致对talinT144A+T150A的影响为:苏氨酸磷酸化水平的下降和PKC活性的增强;而对talinS446A的影响为:丝氨酸磷酸化水平的下降和PKA活性的增强。talinT144A+T150A蛋白的表达刺激Calpain介导的蛋白裂解，因而刺激粘附斑解体和细胞迁移，而talinS446A蛋白表达则能完全抑制talin的calpain酶切，因而阻止粘附斑解体和细胞迁移。PKC通过MAPK级联信号途径激活ERK并最终激活calpain，而PKA则表现为:不能完全抑制ERK的激活，但对抵消calpain的酶切活性。这些结果证实和强调了PKC或PKA诱导位点特异的Talin高化学计算磷酸化调控Calpain介导的蛋白裂解和粘附斑解体，因此控制粘附斑稳定性，细胞粘附并最后调控细胞迁移的巨大作用。本文的创新点有以下几点:一是所用细胞系全是经过BD FACSAriaⅢ流式细胞分选仪（在488nm波长下激发）最终分拣得到的完全均一的EGFP阳性细胞群;二是第一次把calpain酶切的机制和高化学计算磷酸化机制结合在一起进行阐述;三是所得实验结果不仅完全符合假设，而且能和MAPK信号途径产生新的联系，是基础领域内新的突破性进展。

目录

摘要

1．引言与文献综述

1．1 细胞迁移、细胞粘附的形成与解体

1．2 Talin蛋白

1．3 Calpain 2的酶切

1．4 重组PCR法诱导定点突变

1．5 研究目的和意义

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 仪器设备

2．1．2 主要试剂和耗材

2．1．3 动物细胞系与菌种

2．1．4 常用溶液的配制方法

2．2 方法与步骤

2．2．1 Talin(头部片段)定点突变及表达载体的构建

2．2．2 细胞培养

2．2．3 蛋白的处理

2．2．4 Western blotting技术

2．2．5 免疫荧光双定位试验

2．2．6 非放射性检测PKC或PKA的活性

2．2．7 细胞迁移和细胞粘附实验

3 结果与分析

3．1 Calpain 2酶切效果检测

3．2 RNA干扰确认calpain 2的酶切功能

3．3 苏氨酸或丝氨酸的磷酸化抗体检测

3．4 PKC，PKA含量测定

3．5 MAPK级联途径，ERK的激活

3．6 免疫荧光双定位验证粘附斑的形成

3．7 粘附斑实时观察解体

3．8 细胞群粘附水平直观比较

3．9 细胞群粘附水平定量比较

3．10 Wound-healing (划痕) assays和Transwell assays

4．讨论

4．1 粘附斑形成，解体与细胞迁移

4．2 与MAPK级联途径建立联系

4．3 实验中遇到的困难及解决办法

5 结语

参考文献

致谢

攻读学位期间科研成果

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