一种基于比色法或电化学法测定蛋白激酶PKA的活性的方法

摘要

本发明公开了一种基于比色法或电化学法测定蛋白激酶PKA的活性的方法，该方法以单链DNA(dC

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定蛋白激酶PKA的活性的方法，特别涉及一种构建分子探针，利用比色法或电化学方法测定蛋白激酶活性的方法；属于生物传感技术领域。

背景技术

蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，能够调节细胞内大多数蛋白的功能。磷酸化的蛋白与众多生理过程紧密相关，如信号传导、代谢调控、DNA损伤修复、基因转录和细胞凋亡等。蛋白激酶是一种磷酸转移酶，能够将三磷酸腺苷(ATP)上的γ-磷酸基团转移到底物蛋白特定的酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)残基上。蛋白激酶是酶家族的重要成员。活性正常的蛋白激酶体系是细胞信号传导运作的核心，但当其活性异常或者过度表达时就会引起某些蛋白磷酸化异常。人类许多疾病就和蛋白磷酸化异常密切相关，如癌症、糖尿病及阿兹海默等。由于蛋白激酶调控着每个组织、每个器官、甚至每个细胞的生死，从而已成为早期诊断和治疗这些复杂疾病的重要药物靶点。因此，测定蛋白激酶的活性进而筛选高效的蛋白激酶抑制剂在生物医学诊断以及酶靶药物开发等领域激起了人们广泛的兴趣。

人们已经开发出来大量检测PKA活性的手段，比如电化学法、荧光法、表面等离子体共振法、放射性同位素标记法和免疫法等，这些检测手段和方法在一定程度上促进了对蛋白激酶活性研究，然而又各自具有一定的局限性。放射性元素标记技术，检测方法直接，灵敏度高，但存在放射性污染，不能进行组织标记；免疫法对磷酸化识别抗体的要求较高，专一性不强，费用高。因此，开发快速、简便、经济、灵敏度高且无需标记的蛋白激酶活性检测及高通量筛选抑制剂方法是非常必要的。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是在于提供一种操作简单、灵敏度高、成本低、且检测用时短的通过比色法或电化学方法测定蛋白激酶PKA活性的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于比色法测定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步骤：

1)采用含胞嘧啶单链DNA作为模板和稳定剂，以AgNO₃为原料及以NaBH₄为还原剂通过还原法，生成由纳米银分散负载在含胞嘧啶单链DNA上构成的AgNCs；

2)将含AgNCs的溶液与ZrOCl₂溶液进行混合反应，得到混合液；

3)将Mg(NO₃)₂溶液、多肽溶液、ATP溶液和PKA溶液进行混合反应，得到酶反应液；

4)将所述酶反应液与所述混合液进行混合反应，即得分子探针溶液；

5)所述分子探针溶液与银染液混合，避光反应，通过ImageJ2x软件测定反应产物的相应平均灰度值；

6)采用一系列不同浓度的PKA溶液，重复3)、4)和5)步骤，得到一系列相应的平均灰度值，建立PKA浓度与平均灰度值关系的标准曲线；

7)采用待测Hela细胞裂解液，重复3)、4)和5)步骤，通过标准曲线，确定待测Hela细胞裂解液中PKA的浓度。

优选的方案，基于比色法测定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步骤：

I)在避光条件下，将16～20μL浓度为0.8～1.2mM>3溶液和28～32μL浓度为80～120μM>4溶液，进行还原反应，即得AgNCs；

II)将45～55μL浓度为160～200μM的AgNCs溶液与8～12μL浓度为0.8～1.2mMZrOCl₂溶液混合，震荡1～2min后，静置反应15～25min，得到混合液；

III)将8～12μL浓度为80～120mM的Mg(NO₃)₂、8～12μL浓度为23～27μM的多肽、8～12μL浓度为40～60μM的ATP溶液和8～12μL浓度为0U/mL的PKA混合，在25～40℃条件下，反应1～2h，得到酶反应液；

IV)在所述混合液中加入所述酶反应液30～50μL，震荡1～2min，静置反应15～25min，即得分子探针溶液；

V)将所述分子探针溶液与80～120μL银染液混合，避光反应，通过ImageJ2x软件测定反应产物的相应平均灰度值；

VI)采用浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.5U/mL的PKA溶液，重复III)、IV)和V)步骤，得到一系列相应的平均灰度值，建立PKA浓度与平均灰度值的标准曲线；

VII)采用待测Hela细胞裂解液，重复III)、IV)和V)步骤，通过标准曲线，确定待测Hela细胞裂解液中PKA的浓度。

较优选的方案，基于比色法测定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步骤：

I)在避光条件下，将18μL浓度为1mM>3溶液和30μL浓度为100μM>4溶液，进行还原反应，即得AgNCs；

II)将50μL浓度为180μM的AgNCs溶液与10μL浓度为1mM ZrOCl₂溶液混合，震荡1～2min，静置反应15～25min，得到混合液；

III)将10μL浓度为100mM的Mg(NO₃)₂、10μL浓度为25μM的多肽、10μL浓度为50μM的ATP溶液和10μL浓度为0U/mL的PKA，在25～40℃条件下，反应1～2h，得到酶反应液；

IV)在所述混合液中加入所述酶反应液40μL，震荡1～2min静置反应15～25min，即得分子探针溶液；

V)将所述分子探针溶液与100μL银染液混合，避光反应，通过ImageJ2x软件测定反应产物的相应平均灰度值；

VI)采用浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.5U/mL的PKA溶液，重复III)、IV)和V)步骤，得到一系列相应的平均灰度值，建立PKA浓度与平均灰度值的标准曲线；

VII)采用待测Hela细胞裂解液，重复III)、IV)和V)步骤，通过标准曲线，确定待测Hela细胞裂解液中PKA的浓度。

本发明还提供了一种基于电化学法测定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步骤：

a)采用含胞嘧啶单链DNA作为模板和稳定剂，以AgNO₃为原料及以NaBH₄为还原剂通过还原法，生成由纳米银分散负载在含胞嘧啶单链DNA上构成的AgNCs；

b)将含AgNCs的溶液与ZrOCl₂溶液进行混合反应，得到混合液；

c)将Mg(NO₃)₂溶液、多肽溶液、ATP溶液和PKA溶液进行混合反应，得到酶反应液；

d)将所述酶反应液与所述混合液进行混合反应，即得分子探针溶液；

e)将分子探针溶液滴加在玻碳电极表面，烘干后，置于银染液中浸泡，再通过方波伏安法检测，得到相应的电流信号值；

f)采用一系列不同浓度的PKA溶液，重复c)、d)和e)步骤，得到一系列相应的电流信号值，建立PKA浓度与电流信号值关系的标准曲线；

g)采用待测Hela细胞裂解液，重复c)、d)和e)步骤，通过标准曲线，确定待测Hela细胞裂解液中PKA的浓度。

优选的方案，基于电化学法测定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步骤：

i)在避光条件下，将16～20μL浓度为0.8～1.2mM>3溶液和28～32μL浓度为80～120μM>4溶液，进行还原反应，即得AgNCs；

ii)将23～27μL浓度为160～200μM的AgNCs与3～7μL浓度为0.8～1.2mM ZrOCl₂混合，震荡1～2min，静置反应15～25min，得到混合液；

iii)将3～7μL浓度为80～120mM的Mg(NO₃)₂溶液、3～7μL浓度为23～27μM的多肽溶液、3～7μL浓度为45～55μM的ATP溶液和3～7μL浓度为0U/mL的PKA溶液混合，在25～40℃条件下，反应1～2h，得到酶反应液；

iv)将所述混合液与18～22μL所述酶反应液，震荡1～2min，静置反应15～25min，即得分子探针溶液。

v)将7～8μL分子探针溶液滴加在玻碳电极表面，在30～40℃温度下，烘干后，置于银染液中浸泡2～4min，以1M KCl作为电解质，在-0.15～0.25V范围内，15HZ的频率扫方波伏安曲线，得到相应的电流信号值；

vi)采用浓度分别为0.01、0.05、0.2、0.4、0.6、0.75、1U/mL的PKA溶液，重复iii)、iv)和v)步骤，得到一系列相应的电流信号值，建立PKA浓度与电流信号值关系的标准曲线；

vii)采用待测Hela细胞裂解液，重复iii)、iv)和v)步骤，通过标准曲线，确定待测Hela细胞裂解液中PKA的浓度。

较优选的方案，基于电化学法测定蛋白激酶PKA活性的方法包括以下步骤：

i)在避光条件下，将18μL浓度为1mM>3溶液和30μL浓度为100μM>4溶液，进行还原反应，即得AgNCs；

ii)将25μL浓度为180μM的AgNCs与5μL浓度为1mM ZrOCl₂混合，震荡1～2min，静置反应15～25min，得到混合液；

iii)将5μL浓度为100mM的Mg(NO₃)₂溶液、5μL浓度为25μM的多肽溶液、5μL浓度为50μM的ATP溶液和5μL浓度为0U/mL的PKA溶液混合，在25～40℃条件下，反应1～2h，得到酶反应液；

iv)将所述混合液与20μL所述酶反应液，震荡1～2min，静置反应15～25min，即得分子探针溶液。

v)将7.5μL分子探针溶液滴加在玻碳电极表面，在30～40℃温度下，烘干后，置于银染液中浸泡3min，以1M KCl作为电解质，在-0.15～0.25V范围内，15HZ的频率扫方波伏安曲线，得到相应的电流信号值；

vi)采用浓度分别为0.01、0.05、0.2、0.4、0.6、0.75、1U/mL的PKA溶液，重复iii)、iv)和v)步骤，得到一系列相应的电流信号值，建立PKA浓度与电流信号值关系的标准曲线；

vii)采用待测Hela细胞裂解液，重复iii)、iv)和v)步骤，通过标准曲线，确定待测Hela细胞裂解液中PKA的浓度。

较优选的方案，含胞嘧啶单链DNA序列为CCC CCC CCC CCC。

较优选的方案，银染液包含AgNO₃和对苯二酚。

本发明的基于比色法测定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步骤：

(1)合成AgNCs：以富含胞嘧啶的单链DNA(CCC CCC CCC CCC，dC₁₂)同时作为模板和稳定剂，NaBH₄还原AgNO₃合成水溶性好、荧光强度稳定的AgNCs；首先，用12000r/min的转速在4℃条件下将DNA离心30～60min，加127μL二次水于1OD的DNA中稀释，使其浓度达到100μM，再用二次水配1mM>3，避光保存在4℃冰箱中备用；取18μL 1mM>3溶液和30μL>+:DNA＝6:1)加入到盛有34μL二次水的棕色离心管中，在室温下震荡30～60min，然后将18μL新配制1mM的NaBH₄(冰的二次水作为溶剂)迅速加入上述DNA和AgNO₃混合液中，使得NaBH₄迅速还原Ag⁺为AgNCs；将最终的反应液放在4℃冰箱中避光保存3～4个小时，即合成AgNCs；

(2)优化ATP的浓度：ATP能够抑制银染反应发生，需对其浓度进行优化；在96孔板的孔中先加入50μL上述合成的AgNCs，从左至右依次加入50μL不同浓度的ATP，使其最终浓度为2.5、5、10、20、40μM，最后再加入100μL银染液(银染液A：银染液B＝1:1)；观察变黑的时间分别为5、15、20、30、40、90min，考虑到试验过程的时间限制选定5μM作为最佳浓度；

(3)比色法测定蛋白激酶PKA的活性，将10μL 100mM Mg(NO₃)₂、10μL>2(Zr⁴⁺最终浓度为100μM)，震荡1～2min后反应15～25min，再取上述酶40μL加入酶标板中，震荡1～2min后静置反应15～25min，最后加入100μL银染液(银染液A和银染液B混合，现配现用)，用锡箔纸密封避光反应，每隔1min拍照记录银染反应的程度，再通过ImageJ2x软件测定固定面积的平均灰度值；

本发明的基于电化学法测定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步骤：

(1)处理电极：将直径3mm的玻碳电极在含有0.05μm的Al₂O₃的抛光布上进行抛光，抛光后的电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗3～5分钟，可将附着于电极表面的抛光粉清除干净，之后用氮气吹干；将处理好的玻碳电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极共同放入装有5mmol·L^-1的铁氰化钾溶液的反应池内，在-0.1～0.6V电压下，进行循环伏安法扫描，设定扫描速度为0.1V·s^-1，电位差小于85mV，表明玻碳电极表面被处理干净，有利于电极修饰；

(2)电化学法测定蛋白激酶PKA的活性：将5μL 100mM Mg(NO₃)₂、5μL>2(Zr⁴⁺最终浓度为100μM)，震荡1～2min后静置反应15～25min，再取上述酶20μL加入离心管中，震荡1～2min后再静置反应15～25min，得到多肽包裹的AgNCs；将银染液A和银染液B均稀释10倍，分装在两个避光的离心管中；取7.5μL多肽包裹的AgNCs滴加在处理好的玻碳电极表面，在30～40℃的烘箱中，大约40min烘干；取30μL稀释好的银染液于0.5mL的离心管中，将修饰好的电极浸泡在银染液中，3min后取出，敲掉电极表面残留的银染液，用擦镜纸擦去粘在电极周围的银染液，以1M>

相对现有技术，本发明的技术带来的有益技术效果：

本发明的技术方案充分利用PKA催化水解ATP并可以将ATP的γ磷酸根转移到多肽底物的丝氨基酸上的原理，以单链DNA(dC₁₂)为模板及稳定剂，通过还原法先制备AgNCs，再将磷酸化的多肽通过Zr⁴⁺与AgNCs的模板DNA结合在一起，形成由磷酸化的多肽包裹AgNCs的分子探针。该分子探针具有明显的优势，可以用于比色法或电化学法测定蛋白激酶PKA的活性。该分子探针利用磷酸化的多肽包裹在AgNCs表面，抑制银染反应，通过溶液颜色深浅，测灰度值，灰度值的大小与PKA活性成负相关；同时，AgNCs在电极表面会产生电信号，银染反应促使AgNCs粒径变大，使得信号值大大地增强，磷酸化的多肽抑制银染反应从而使电信号增强程度减慢。

本发明的比色法不需要昂贵的仪器，操作简便，裸眼可直接观察实验结果。

本发明的电化学法简单、灵敏、快速，且与比色法相互印证，突出了本发明方法的可靠性。

附图说明

【图1】为本发明构建的分子探针用于比色法或电化学法测定蛋白激酶PKA的活性原理图。

【图2】为本发明从电荷角度说明磷酸化的多肽包裹在AgNCs表面直方图。

【图3】为本发明实例1中合成AgNCs的透射电镜图。

【图4】为本发明实例3中ATP浓度优化图，从左至右ATP浓度分别为2.5、5、10、20、40μM。

【图5】为本发明实施例5中不同浓度的PKA酶反应液及单独AgNCs与银染液反应25min时的可视化图。

【图6】为本发明实施例5中不同浓度PKA的相对灰度值标准曲线，检测范围为0.1～0.5U/mL。

【图7】为本发明实例5中不同浓度药物刺激Hela细胞酶反应液与银染液反应10min时的可视化图。

【图8】为本发明实施例6中不同浓度的PKA电化学响应信号图。

【图9】为本发明实施例6中不同浓度的PKA电化学标准曲线，检测范围为0.01U/mL～0.75U/mL。

【图10】为本发明实例6中不同浓度药物刺激Hela细胞酶反应液与银染液反应电化学相应信号图。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，但本发明权利要求保护范围不限于以下实施例。

实施例1

以富含胞嘧啶的单链DNA(CCC CCC CCC CCC，dC₁₂)同时作为模板和稳定剂，NaBH₄还原AgNO₃合成水溶性好、荧光强度稳定的AgNCs。首先，用12000r/min的转速在4℃条件下将DNA离心30～60min，加127μL二次水于1OD的DNA中稀释，使其浓度达到100μM，再用二次水配1mM>3，避光保存在4℃冰箱中备用。取18μL 1mM>3溶液和30μL100μM>+:DNA＝6:1)加入到盛有34μL二次水的棕色离心管中，在室温下震荡30～60min，然后将18μL新配制1mM的NaBH₄(冰的二次水作为溶剂)迅速加入上述DNA和AgNO₃混合液中，使得NaBH₄迅速还原Ag⁺为AgNCs。将最终的反应液放在4℃冰箱中避光保存3～4个小时，即合成AgNCs。

实施例2

将直径3mm的玻碳电极在含有0.05μm的Al₂O₃的抛光布上进行抛光，抛光后的电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗3～5分钟，可将附着于电极表面的抛光粉清除干净，之后用氮气吹干。将处理好的玻碳电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极共同放入装有5mmol·L^-1的铁氰化钾溶液的反应池内，在-0.1～0.6V电压下，进行循环伏安法扫描，设定扫描速度为0.1V·s^-1，电位差小于85mV，表明玻碳电极表面被处理干净，盖好电极帽放在4℃的冰箱中备用。

实施例3

ATP能够抑制银染反应发生，需对其浓度进行优化。在96孔板的孔中先加入50μL上述合成的AgNCs，从左至右依次加入50μL不同浓度的ATP，使其最终浓度为2.5、5、10、20、40μM，最后再加入100μL银染液(银染液A：银染液B＝1:1)。观察变黑的时间分别为5、15、20、30、40、90min，考虑到试验过程的时间限制选定5μM作为最佳浓度。

实施例4

提取实际样品(Hela细胞裂解液)中PKA：用含有胎牛血清和双抗的1640培养基，在36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO₂及湿润的环境中培养Hela细胞。细胞到对数生长期时用胰蛋白酶将其消化下来，呈悬浮状，用不同浓度比例的毛喉素(腺苷酸环化酶激活剂)和IBMX(环腺苷酸磷酸二酯酶抑制剂)来刺激Hela细胞(具体浓度见图10内表)，20～60min后产生不同浓度PKA。用细胞破碎仪将得到的Hela细胞以20kHz的频率，在0℃下破碎30～60min，再以10000～12000r/min在4℃下离心10～30min，除去细胞器，得到的上清液即为含有PKA的Hela细胞裂解液。

实施例5

将10μL 100mM MgNO₃、10μL>2(Zr⁴⁺最终浓度为100μM)，震荡1～2min后反应15～25min，再取上述酶反应液40μL加入酶标板中，震荡1～2min后静置反应15～25min，最后加入100μL银染液(银染液A和银染液B混合，现配现用)，用锡箔纸密封避光反应，每隔1min拍照记录银染反应的程度，再通过ImageJ2x软件测定固定面积的平均灰度值，做标准曲线，R²＝0.97856。

实际样品中PKA活性的测定，按以上操作将不同浓度的PKA换成不同浓度药物刺激的Hela细胞裂解液，可以看出随着刺激药物浓度增大，银染反应抑制程度随之增大，颜色变浅。

实施例6

将5μL 100mM Mg(NO₃)₂、5μL>2(Zr⁴⁺最终浓度为100μM)，震荡1～2min后静置反应15～25min，再取上述酶20μL加入离心管中，震荡1～2min后再静置反应15～25min，得到多肽包裹的AgNCs。将银染液A和银染液B均稀释10倍，分装在两个避光的离心管中。取7.5μL多肽包裹的AgNCs滴加在处理好的玻碳电极表面，在30～40℃的烘箱中，大约40min烘干。取30μL稀释好的银染液于0.5mL的离心管中，将修饰好的电极浸泡在银染液中，3min后取出，敲掉电极表面残留的银染液，用擦镜纸擦去粘在电极周围的银染液，以1M>2＝0.98697。

实际样品中PKA活性的测定，按以上操作将不同浓度的PKA换成不同浓度药物刺激的Hela细胞裂解液，可以看出随着刺激药物浓度增大，银染反应抑制程度随之增大，电化学信号强度逐渐变小。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。