p53对PA28γ基因转录调控的影响

摘要

肿瘤抑制因子p53主要作为转录因子发挥作用。野生型p53在正常细胞中表达低。当细胞遭受DNA损伤、缺氧等胁迫时，细胞中的p53蛋白将会积累并被激活，调控其靶基因的转录，促使细胞周期停滞、凋亡或衰老。
　　PA28γ(又叫REGγ，11Sγ，PSME3)是20S蛋白酶体的激活因子之一，可以和20S蛋白酶体结合，激活其不依赖ATP和泛素的蛋白质降解途径。另外，PA28γ可以促进MDM2介导的P53的单泛素化和/或多泛素化，从而导致p53的核输出和/或降解。PA28γ在DNA损伤修复、细胞增殖、癌变、神经退行性疾病等多种生理、病理过程中发挥重要作用。但是，该基因的表达调控机制尚不清楚。为了阐明该基因的转录调控机制，本文对PA28γ基因的转录起始位点、启动子及其转录调控了进行研究。
　　本文利用RLM-RACE(RNA连接酶介导的cDNA末端快速克隆)的方法，确定了PA28γ基因的转录起始位点。用荧光素酶实验分析显示PA28γ基因的基本启动子在-193到+16区域。通过生物信息学分析，发现在PA28γ基因的启动子上有三个p53应答元件（即，p53蛋白结合位点）。染色质免疫共沉淀和生物素亲和沉淀分析实验都证实p53蛋白可以结合到这些p53应答元件上。荧光素酶分析和Western印迹等实验结果表明，过表达p53可以增强PA28γ基因的启动子活性并上调PA28γ基因的表达，而干扰p53基因则抑制PA28γ基因的启动子活性和表达。而且，P53刺激的PA28γ转录能够被PA28γ自身所抑制。这些结果说明P53和PA28γ能形成一个负反馈调节环，维持P53和PA28γ在细胞内的平衡。
　　本文的研究结果不仅初步阐明了PA28γ基因转录调控机制，而且有助于增进人们对p53功能的认识。

目录

摘要

英文缩写表

1 前言

1．1 p53蛋白的功能简介

1．1．1 p53主要作为转录因子发挥抑癌功能

1．1．2 p53功能失活是癌症发生的主要原因之一

1．2 PA28γ基因的功能简介

1．2．1 PA28γ是一个蛋白酶体激活因子

1．2．2 PA28γ在细胞增殖、凋亡和癌症发生等过程中都发挥重要功能

1．3 本论文研究思路和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞株和菌种

2．1．2 载体和工具酶

2．1．3 试剂盒

2．1．4 抗体

2．2 质粒构建

2．2．1 PA28γ基因表达质粒的构建

2．2．2 构建启动子质粒和启动子缺失质粒

2．2．3 构建p53应答元件质粒

2．3 生物信息学分析启动子

2．4 细胞培养

2．4．1 细胞解冻

2．4．2 细胞传代

2．4．3 细胞冻存

2．4．4 细胞转染

2．5 RLM-RACE(RNA酶介导的cDNA末端快速克隆)分析

2．6 蛋白质印迹(Western blotting)

2．6．1 提取细胞总蛋白(10cm皿)

2．6．2 Western-blotting

2．7 荧光素酶分析

2．8 构建p53shRNA和controlshRNA的稳定细胞系

2．9 染色质免疫共沉淀

2．10 His蛋白的诱导表达和纯化

2．10．1 His蛋白的诱导表达

2．10．2 His蛋白的纯化

2．11 生物素亲和沉淀分析

2．12 统计学分析

3 结果

3．1 确定PA28γ基因的转录起始位点

3．2 确定PA28γ基因的基本启动子

3．3 P53与PA28γ基因的启动子结合

3．4 p53促进PA28γ基因的转录

3．5 p53诱导的PA28γ基因转录能够被PA28γ自身所抑制

4 讨论

参考文献

附录(攻读硕士学位期间发表的学术论文目录)

致谢

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