利用斑马鱼模型研究基因CXXC5在心脏发育中的作用

摘要

本文利用斑马鱼模型与细胞模型研究基因zCXXC5在心脏与骨骼肌发育中的作用。
　　zCXXC5基因定位于斑马鱼21号染色体上，共含有4个外显子，跨基因组序列长达73.5kb。其mRNA长2622bp，ORF长855bp;编码的蛋白质含有284个氨基酸残基，分子量为32.24 kDa。生物信息学分析表明，CXXC5蛋白含有CXXC型锌指结构域，在不同的物种进化过程中是保守的。
　　我们制备了zCXXC5蛋白的抗体，免疫印迹实验发现CXXC5在斑马鱼的心脏等多种组织中有高水平的表达，斑马鱼整胚原位杂交实验也表明CXXC5在心脏中有强表达。荧光亚细胞定位实验表明zCXXC5主要表达于细胞核中。
　　通过morpholinos反义核苷酸敲减技术，我们发现敲低zCXXC5基因的表达导致斑马鱼心脏不能正常环化，围心腔有不同程度的膨大，心脏的心室明显变小。因而心输出量减小，严重影响了心脏的功能。我们采用本室建立的心脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼Tg(nppa:gfp)作为模型进行心脏表型和心肌细胞的数目及形态分析。心肌细胞数目的统计发现，心脏不能正常环化的胚胎心室中，其心肌细胞数目明显减少，说明zCXXC5参与了发育早期心室心肌细胞的增殖调控。
　　通过免疫共沉淀的方法检测人的SMAD蛋白家族得到与zCXXC5相互作用的蛋白hSMAD3与hSMAD2。GST-Pull down实验与亚细胞共定位实验也证明zCXXC5与hSMAD3和hSMAD2存在相互作用，进一步用免疫共沉淀实验鉴定了zCXXC5与hSMAD2和hSMAD3相互作用的作用结构域。
　　RT-PCR实验分析表明，morpholino反义寡核苷酸敲低zCXXC5的表达导致心脏标记Nkx2.5、Hand2、Has2、Myh6和Vmhc等表达下降，提示Nkx2.5、Hand2、Has2、Myh6和Vmhc基因很可能是CXXC5的下游基因。我们利用斑马鱼Hand2基因加帽mRNA进行拯救实验，结果表明Hand2基因的mRNA能够拯救morpholino反义寡核苷酸敲低CXXC5表达所产生的异常。
　　已有报道CXXC5是视黄酸途径的反应因子，又与DVL相互作用参与WNT信号途径，提示CXXC5可能通过多条信号途径进行调控。我们利用荧光报告系统实验，检测CXXC5对多种信号途径的作用。实验表明CXXC5在骨骼肌分化信号途径中也具有重要的作用。我们利用C2C12细胞系研究证明了CXXC5在骨骼肌分化形成中的作用。
　　研究表明，在C2C12成肌细胞系分化过程中CXXC5表达量增加，与标志基因的增加呈正相关关系;在C2C12细胞系中过表达CXXC5则进一步促进C2C12成肌细胞的分化，而且成肌细胞分化的标志基因也呈增加趋势;而在C2C12细胞系中干扰CXXC5的表达，则C2C12细胞系的分化明显被抑制，表明CXXC5在骨骼肌发育和分化中也起重要的调控作用。

目录

摘要

第一章 研究背景和文献综述

1．1 斑马鱼心脏发育概述

1．1．1 斑马鱼心肌前体的特化和分化

1．1．2 斑马鱼心管的形成和心脏形态发生

1．1．3 模式形成和形态发生之间紧密联系

1．2 脊椎动物心脏发育的重要转录因子

1．2．1 基本心脏发生

1．2．2 总结与未来方向

1．3 TGF β信号途径在心脏发育中的作用

1．4 CXXC5基因的研究背景和本研究的目标

1．4．1 CXXC5基因的研究背景

1．4．2 本研究的目标和意义

第二章 CXXC5基因的克隆及其蛋白对心脏发育的功能

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料、试剂与设备

2．2．2 常规分子生物学实验方法

2．2．3 原核细胞诱导蛋白质表达及多克隆抗体的制备

2．2．4 免疫共沉淀

2．2．5 斑马鱼morpholino技术

2．2．6 斑马鱼整胚原位杂交

2．2．7 斑马鱼整胚抗体染色

2．3 结果

2．3．1 重组质粒的构建

2．3．2 斑马鱼CXXC5与人类SMAD2和SMAD3的基因和蛋白结构分析

2．3．3 家族关系和进化分析

2．3．4 zCXXC5抗体的制备

2．3．5 zCXXC5基因的表达和定位

2．3．6 用斑马鱼morpholino敲减技术确定CXXC5基因的生物学功能

2．3．7 免疫共沉淀确定zCXXC5的相互作用蛋白

2．3．8 zCXXC5蛋白与hSMAD2和hSMAD3蛋白的亚细胞共定位分析

2．3．9 zCXXC5蛋白与hSMAD2或hSMAD3蛋白在体外发生相互作用

2．3．10 RT-PCR检测zCXXC5敲减后心脏特异标记基因的表达差异

2．3．11 用斑马鱼HAND2基因的加帽mRNA作拯救实验

2．4 讨论

第三章 CXXC5促进骨骼肌成肌细胞的分化

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 常规实验材料与方法

3．2．2 RT-PCR引物

3．2．3 C2C12细胞系的分化

3．2．4 荧光素酶报告系统分析

3．2．5 免疫荧光

3．3 结果

3．3．1 HEK-293细胞系的报告基因分析

3．3．2．C2C12细胞系的报告基因分析

3．3．3 CXXC5在骨骼肌成肌细胞和肌细胞中的内源表达

3．3．4 CXXC5基因在肌细胞分化中的功能

3．4 讨论

第四章 结语

参考文献

附录

致谢

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