异源四倍体鲫鲤中基因组以及转录水平的重组现象的发现

摘要

异源四倍体鲫鲤（4nAT）是世界上首例培育成功的两性可育的四倍体动物群体，是通过红鲫(Carassius auratus red var.，2n=100，RCC，♀)和湘江野鲤(Cyprinus carpio L,2n=100，CC，♂)的人工远缘杂交获得，具有雌雄两性可育和遗传性状稳定的特点，代代相传，已经具备了形成一个染色体数目为200的新型的鱼种的前提条件。研究异源四倍体鲫鲤在基因组和转录水平的重组现象对研究远缘杂交过程中的进化具有重要作用。本论文在验证转录组数据的基础上，通过对4个基因不同个体的全长测序初步分析了异源四倍体鲫鲤的重组现象，另外通过与其他物种构建发育进化树进行了比较研究。
　　1.验证转录组数据库
　　在转录组数据库中随机挑选出7个拼接后显示有重组现象的基因，进行大量的测序，共测了至少473条DNA序列、867条cDNA序列。结果显示有4个基因不管是基因组还是转录水平都真的具有重组现象，这四个基因即slc10a3、slc25a20、Tab1、Mrpl1。还有3个基因虽然目前没有验证到重组现象，但也有可能是测序太少的原因。总之，这一结果在很大程度上证明了转录组数据库的真实性和准确性。
　　2.亲子代之间或同一物种不同个体之间核苷酸含量分析
　　通过对鲤鱼、红鲫和异源四倍体鲫鲤的核苷酸含量分析，同一物种不同个体之间同一基因相同核苷酸含量差异较小，基本上不会超过0.4％。异源四倍体鲫鲤做了3个个体，每个个体的A、G、C、T含量在不同基因各有波动，与亲本没有固定规律。亲子代之间同一基因的相同核苷酸含量差异不大，基本上不会超过1％。异源四倍体鲫鲤的slc10a3和slc25a20基因的GC含量在鲤鱼和红鲫之间，均大于50％，大量的研究表明接近60％的启动子附近都伴随有CpG岛，而CpG岛的出现会导致GC含量的提高，所以GC含量大于50％的基因很有可能是功能基因，序列较稳定;异源四倍体鲫鲤的Tab1和Mrpl1基因的GC含量和鲤鱼、红鲫的含量关系存在波动，但均小于50％，就是说AT含量均大于50％，有研究表明AT含量较高时，序列的稳定性可能降低，这可能就是这两个基因核苷酸含量与亲本含量关系存在波动的重要原因。
　　3.PCR和测序结合法进行SNP的筛选
　　本论文通过大量的克隆测序，找出SNP位点并确定碱基替换类型。研究表明，在这些具有重组现象的基因中，C-T和G-A转换的概率明显要大于其他碱基的颠换，在Tab1基因中甚至超过2/3的概率。转换的概率如此高，可能是因为人类基因组中最易发生突变的位点是CpG二核苷酸上的C，C常为甲基化，可自发地脱去氨基而形成T。
　　异源四倍体鲫鲤的SNP位点明显多于其亲本鲤鱼和红鲫的。slc10a3基因中，异源四倍体鲫鲤的SNP位点高达104个，远远多于亲本鲤鱼的21个和红鲫的10个;slc25a20基因中，异源四倍体鲫鲤的SNP位点为51个，而亲本鲤鱼和红鲫分别只有4个和3个;Tab1基因中，异源四倍体鲫鲤的SNP位点为45个，其亲本则都是11个。根据这些SNP位点可以鉴定重组。
　　4.重组类型的分类和DNA序列的基本特征
　　本论文中的四个基因不管在基因组还是转录水平上都有重组现象，将测得的原始杂交序列分类，然后在能分为母本序列和父本序列的情况下，仍然能发现重组序列的存在，就说明重组确实是存在的。异源四倍体鲫鲤中这四个基因的重组序列属于“遗传变异型”，这些序列从分子水平上证明了异源四倍体鲫鲤群体在进化过程中与其亲本相比产生了很大的遗传变异。重组序列从两个方面进行分类，一是根据SNP位点;二是根据与亲本同源序列的组成模式，其中“H-L”类型和“L-H”类型最为常见。
　　这四个基因在鲤鱼、红鲫和异源四倍体鲫鲤中外显子长度没有差异，只有个别核苷酸位点表现出差异，表现出较高的保守性，而这些基因中能检测出内含子的DNA序列均有片段的缺失、插入，且这些都存在于内含子部分，即内含子表现出与外显子不同的保守性。
　　5.系统发育分析
　　利用MEGA5.1软件，对鲤鱼、红鲫、异源四倍体鲫鲤以及其他物种绘制ML系统发育进化树。在四个基因的进化树中，异源四倍体鲫鲤始终与亲本鲤鱼、红鲫处于同一分枝上，与其他物种相比，鲤鱼、红鲫和异源四倍体鲫鲤之间分化程度不高。且这三种鱼始终都与斑马鱼聚集在同一枝上。另外，亲缘关系较近的鱼类始终聚集在同一大的分枝上，同属于哺乳动物的荷兰猪、家鼠等也始终聚集在同一大的分枝上，这在一定程度上证明了本文构建的系统发育树的准确性。
　　总之，四倍体鲫鲤群体在基因组和转录水平上都有重组现象的发生，且重组在进化中可能具有很重要的作用。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 异源四倍体鲫鲤的介绍及研究现状

1．1．1 异源四倍体鲫鲤的介绍

1．1．2 异源四倍体鲫鲤的研究现状

1．2 单核苷酸多态性和基因重组

1．2．1 单核苷酸多态性

1．2．2 基因重组的分类和意义

1．3 本文的研究目的和主要内容

第二章 实验材料和实验方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验鱼

2．1．2 购买的主要实验试剂

2．1．3 配制的主要实验试剂及配方

2．1．4 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 感受态的制备

2．2．3 DNA的提取

2．2．4 RNA的提取

2．2．5 RNA反转录成cDNA

2．2．6 预PCR与琼脂糖凝胶电泳检测

2．2．7 PCR扩增及胶回收

2．2．8 连接

2．2．9 转化

2．2．10 菌液PCR筛选

2．2．11 测序、拼接及验证

2．2．12 序列比较分析

第三章 结果和分析

3．1 鲤鱼、红鲫和异源四倍体鲫鲤中基因克隆和测序结果

3．1．1 基因组DNA的提取与检测结果

3．1．2 RNA的提取和反转录的检测结果

3．1．3 PCR产物纯化结果

3．1．4 菌液PCR(阳性克隆筛选)结果

3．1．5 序列比较验证结果

3．2 slc10a3基因序列分析

3．2．1 L，H，F22中slc10a3基因序列长度比较

3．2．2 L，H，F22中slc10a3基因核苷酸含量比较

3．2．3 L，H，F22中slc10a3基因的克隆测序情况

3．2．4 L，H，F22中slc10a3基因的单核苷酸多态性(SNPs)情况

3．2．5 F22中slc10a3基因的重组类型

3．2．6 L，H，F22中slc10a3基因系统发育分析

3．3 slc25a20基因序列分析

3．3．1 L，H，F22中slc25a20基因序列结构和长度比较

3．3．2 L，H，F22中slc25a20基因核苷酸含量比较

3．3．3 L，H，F22中slc25a20基因的克隆测序情况

3．3．4 L，H，F22中slc25a20基因的单核苷酸多态性(SNPs)情况

3．3．5 F22中slc25a20基因的重组类型

3．3．6 L，H，F22中slc25a20基因系统发育分析

3．4 Tab1基因序列分析

3．4．1 L，H，F22中Tab1基因序列结构和长度比较

3．4．2 L，H，F22中Tab1基因核苷酸含量比较

3．4．3 L，H，F22中Tab1基因的克隆测序情况

3．4．4 L，H，F22中Tab1基因的单核苷酸多态性(SNPs)情况

3．4．5 F22中Tab1基因的重组类型

3．4．6 L，H，F22中Tab1基因系统发育分析

3．5 Mrpl1基因序列分析

3．5．1 L，H，F22中Mrpl1基因序列长度比较

3．5．2 L，H，F22中Mrpl1基因核苷酸含量比较

3．5．3 L，H，F22中Mrpl1基因的克隆测序情况

3．5．4 L，H．F22中Mrpl1基因的单核苷酸多态性(SNPs)情况

3．5．5 F22中Mrpl1基因的重组类型

3．5．6 L，H，F22中Mrpl1基因系统发育分析

第四章 讨论与主要结论

4．1 讨论

4．2 主要结论

参考文献

一．硕士学习期间发表的文章

二．硕士学习期间获得的主要奖项

致谢

声明