核酸适配体对沙门氏菌的检测及其菌膜的控制

摘要

沙门氏菌是一类常见的人畜共患致病菌，由家禽、鸟畜等传染给人类，易引起胃肠炎、败血症、伤寒等感染性疾病，给人类和动物健康造成巨大威胁。其中，以甲型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌较为常见。由沙门氏菌形成的细菌菌膜在宿主体内以及自然环境当中广泛存在，造成疾病难以治愈和反复发作。由甲型副伤寒沙门氏菌可引起的疾病仍在全球范围内持续发生，并越来越引起人类的关注，因此对甲型副伤寒沙门氏菌的实时快速检测已成为必要。猪霍乱沙门氏菌以侵害4个月以下的断奶仔猪为主，诱发仔猪肠道疾病，给养殖业造成直接经济损失。加之其菌膜的形成加剧了菌膜细菌的耐药性，因此发展新方案用于猪霍乱沙门氏菌及其菌膜的控制已迫在眉睫。
　　(1)甲型副伤寒沙门氏菌的高灵敏性循环信号放大检测。本实验以荧光叠加、荧光能量共振转移(FRET)以及限制性核酸内切酶酶解作用为基本原理，构建了一种简单、低成本的DNA适配体传感器用于甲型副伤寒沙门氏菌的荧光检测。该传感器由一条经过延伸的适配体序列、两条末端修饰上FAM的短序列（探针1和探针2）构成。当靶标不存在时，由于适配体传感器与靶标的特异性结合，修饰上FAM的适配体传感器被吸附到氧化石墨烯上，FAM荧光被淬灭;当靶标存在时，修饰上FAM的适配体传感器从氧化石墨烯表面释放出来，从而检测到FAM荧光信号。重要的是，荧光信号可以通过核酸内切酶Ⅰ介导的靶标循环放大。在最优条件下，靶标浓度在1×102到1×1011cells/mL范围内，荧光强度呈现良好的线性关系，且最低检测下限为1×102 cells/mL。因此，证明该种检测平台对致病菌的检测提供了一种高灵敏性和高特异性的检测方法，并为其他细菌的检测提供了可能性。
　　(2)核酸适配体-氨苄青霉素共轭物对猪霍乱沙门氏菌菌膜的控制。本实验以猪霍乱沙门氏菌茵膜为研究对象，以适配体和氨苄青霉素的分子结构为基础，以酰胺反应为连接原理，探索了一种能通过协同作用控制菌膜的新方法。在靶细菌鞭毛蛋白适配体(aptamer3)的3'-末端上修饰氨基，通过酰胺反应使之与氨苄青霉素上的羧基共轭以形成多功能共轭物(Apt-Amp共轭物)。光谱研究确定了共轭物的正确合成，荧光分光光度法证明共轭物保留了适配体的特异性。倒置显微镜和原子力显微镜(AFM)显微镜观察结果表明，共轭物对菌膜具有良好的控制作用。共轭物菌膜抑制效果为71.64％，菌膜消减效果为60.00％，而且效果均优于组分（适配体、抗生素），推测共轭物以协同作用方式作用于菌膜。初步推测其作用机理是利用适配体对猪霍乱沙门氏菌鞭毛蛋白的特异性识别作用附着在菌膜细菌的表面，进而将氨苄青霉素带入菌膜，发挥其自身以及氨苄青霉素的联合抗菌作用以抑制和消减菌膜。

目录

摘要

第一章 引言和文献综述

1．1 沙门氏菌

1．1．1 沙门氏菌的概述及分类

1．1．2 沙门氏菌的流行和危害

1．1．3 沙门氏菌的致病机理

1．1．4 沙门氏菌的检测和治疗

1．2 核酸适配体

1．2．1 适配体的体外筛选

1．2．2 适配体与靶标的作用机理

1．2．3 适配体的特点

1．2．4 适配体的应用及展望

1．3 纳米材料

1．3．1 氧化石墨烯的结构和性质

1．3．2 氧化石墨烯在传感器中的应用

1．4 核酸内切酶

1．4．1 核酸内切酶的应用

1．4．2 脱氧核糖核酸酶I的作用

1．5 细菌菌膜

1．5．1 菌膜的成分及特点

1．5．2 菌膜的形成过程

1．5．3 菌膜的致病机理

1．5．4 菌膜的治疗现状

1．6 抗生素

1．6．1 氨苄青霉素的发现及应用

1．6．2 氨苄青霉素的生成及结构

1．7 本课题的研究内容

第二章 DNase I介导的适配体传感器对甲型副伤寒沙门氏菌的高灵敏性循环放大检测

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 材料与设备

2．2．2 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验的设计原理

2．3．2 反应体系优化

2．3．3 体系可行性分析

2．3．4 琼脂糖凝胶电泳分析

2．3．5 适配体传感器对靶细菌的灵敏性分析

2．3．6 适配体传感器对靶细菌的特异性分析

2．3．7 适配体传感器在模拟样品中的应用

2．4 小结

第三章 适配体辅助的氨苄青霉素作用于猪霍乱沙门氏菌菌膜的功能研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 材料与设备

3．2．2 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 适配体及其浓度、氨苄青霉素浓度确定

3．3．2 Apt-Amp共轭物鉴定

3．3．3 Apt-Amp共轭物对靶细菌的特异性检测分析

3．3．4 Apt-Amp共轭物对菌膜的抑制

3．3．5 Apt-Amp共轭物对菌膜的消减

3．3．6 倒置荧光显微镜结果分析

3．3．7 原子力显微镜结果分析

3．4 小结

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间撰写、发表的学术论文

致谢

附录

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