Vimentin野生型和E151K突变体稳定表达晶状体细胞株的建立

摘要

波形蛋白Vimentin是一种在内皮或者其他间质细胞中表达的Ⅲ型中间纤维蛋白，眼睛晶状体上皮细胞中就有大量表达的波形蛋白。波形蛋白有三个结构域，由一个含α螺旋的中心杆域连接N端的头部域和C端的尾部域。作为一种主要的骨架蛋白，波形蛋白参与细胞核与膜的连接和信号转导，影响晶状体细胞的分化，与细胞的迁移和运动有关，在伪足中就有波形蛋白。波形蛋白还受磷酸化作用的调节，蛋白激酶C可调控它的一些磷酸化位点。此外，波形蛋白在癌细胞中高表达使癌细胞获得侵袭性。晶状体正常状态的维持与波形蛋白息息相关，波形蛋白基因突变会导致波形蛋白组装紊乱从而引发疾病。波形蛋白编码基因外显子1第596号碱基的突变(G596A)造成第151号位的谷氨酸突变成赖氨酸(E151K)，导致Vimentin骨架蛋白组装紊乱。由于跟SUMO特异性结合的底物一般都具有一个相同的基序KxE/D，其中Ψ为疏水性氨基酸，K为目标赖氨酸，x是任何氨基酸，所以E151K的突变将导致一个十分保守的SUMO化位点的产生。我们推测E151K突变可能导致Vimentin单体被SUMO化，造成晶状体中波形蛋白纤维组装困难，从而产生白内障。为了证明此推测，我们构建了Vimentin野生型和E151K cDNA突变体的质粒，并把野生型和突变体质粒分别转入了小鼠的晶状体上皮细胞α-TN4-1中，用含有600ug/ml的G418培养基筛选，建立了稳定表达的细胞株，并用免疫荧光染色技术观察到了转染细胞与正常细胞的形态差异。为进一步确定E151K是否能被SUMO化而导致Vimentin组装病变打下了必要的基础。
　　通过实验我们发现:正常的α-TN4-1细胞的波形蛋白骨架十分清晰，在远核端汇聚形成的放射线笔直而修长;转染了VIM的细胞虽也观察到由波形蛋白形成的细长的延伸部分，但明显在延伸的多处都发生了弯曲;而转染了E151K的细胞则观察不到延伸部分或延伸部分明显缩减，波形蛋白围绕在核周围呈不规则弥散状。

目录

摘要

第一章 前言

1 中间纤维家族

1．1 中间纤维的结构

1．2 中间纤维和细胞骨架

1．3 中间纤维和眼睛晶状体

2 波形蛋白(Vimentin)

2．1 波形蛋白的结构

2．2 波形蛋白组装和去组装

2．3 波形蛋白和细胞接触

2．4 波形蛋白和信号转导

2．5 波形蛋白和细胞运动

2．6 波形蛋白和癌细胞

2．7 胚胎发生中波形蛋白的表达

2．8 波形蛋白突变E151K和白内障

3 小泛素相关修饰物(SUMO)

3．1 SUMO家族

3．2 SUMO与泛素化

3．3 SUMO化修饰的酶学

3．4 SUMO化的功能

4 本课题研究背景

第二章 材料、试剂以及研究方法

1 本实验的材料

2 本实验的试剂

3 实验仪器

4 实验方法

4．1 获得小鼠晶状体CDNA

4．2 克隆小鼠晶状体Vimentin

4．3 克隆小鼠VIM突变体E151K

4．4 保存VIM和E151K的质粒及菌液

4．5 建立Vimentin和E151K稳定的晶状体细胞株

4．6 PCR检测Vimentin和E151K稳定转染的晶状体细胞株

4．7 细胞免疫荧光染色

第三章 实验结果与讨论

1 实验结果

1．1 小鼠VIM PCR瞄果及序列比对

1．2 小鼠突变体E151K PCR结果及序列比对

1．3 检测PCR结果

1．4 免疫荧光染色结果图

2 实验讨论

参考文献

硕士期间发表的论文情况

致谢

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