索拉非尼诱导多发性骨髓瘤U266细胞凋亡及其机制研究

摘要

目的:本实验旨在研究索拉非尼(sorafenib)对人多发性骨髓瘤（MM）细胞株U266的增殖与凋亡的作用及其相关作用机制，为MM的临床治疗寻求新的分子靶向药物及提供理论依据。
　　方法:用MTT法检测MM细胞株U266在不同浓度索拉非尼作用下增殖的抑制率;用流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡率;设计VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、c-KIT等索拉非尼作用靶点引物，运用Q-PCR技术对索拉非尼处理过的MM细胞株U266进行检测，初步确定索拉非尼的作用靶点;最后用Western-blot方法检测蛋白的表达情况以验证Q-PCR筛选结果。
　　结果:不同浓度索拉非尼对MM细胞株U266的抑制增殖和促进细胞凋亡的作用有差异，实验结果证实其抑制率呈现出一定程度的时间-浓度依赖性（P＜0.05），其凋亡率呈现浓度依赖性（P＜0.05），不同浓度索拉非尼作用于MM细胞48 h之后，与对照组比较VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、c-KIT的mRNA表达均下调，其中VEGFR-3、PDGFR-β下调最为显著，且经Western-blot检测出VEGFR-3、PDGFR-β的蛋白表达情况与Q-PCR的结果相一致（P＜0.05）。
　　结论:索拉非尼体外能够抑制MM细胞株U266的增殖并加速细胞凋亡，且相关机制可能与索拉非尼能抑制心细胞株U266表面相关受体（如:VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β）被激活有关。

目录

摘要

前言

材料

1 实验药品及细胞株

2 主要试剂

3 主要实验仪器

4 培养液与相关试剂的配制

4．1 胎牛血清的分装

4．2 RPMI 1640培养基的配制

4．3 人多发性骨髓瘤细胞培养液的制备

4．4 PBS平衡盐溶液的制备

方法

1 人多发性骨髓瘤细胞株U266的培养

2 冻存与复苏细胞

3 MTT检测细胞增值抑制率

4 应用流式细胞仪检测索拉非尼处理后的多发性骨髓瘤细胞的凋亡率

5 O-PCR检测目的基因表达

5．1 RNA提取

5．2 RNA反转录

5．3 QRT-PCR引物序列

5．4 扩增曲线的建立

5．5 熔解曲线的建立

5．6 Q-PCR相对表达量结果统计

6 Western-blot检测目的蛋白表达

6．1 第一步：样品制备

6．2 蛋白浓度检测

6．3 western blot

7 实验技术路线图的设计

7．1 索拉非尼对人多发性骨髓瘤细胞系U266细胞生物学特性的影响

7．2 检测索拉非尼影响人多发性骨髓瘤系U266细胞的差异靶基因

结果

1 索拉非尼处理MM细胞系U266后24h、48h、72h倒置显微镜下细胞形态图

2 应用MTT法检测索拉非尼对MM细胞系U266增殖影响

3 用流式细胞仪检测索拉非尼对洲细胞系U266凋亡的影响

4 索拉非尼对多发性骨髓瘤(MM)细胞U266 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β及c-Kit基因表达的影响

4．1 扩增曲线

4．2 熔解曲线

4．3 Q-PCR相对表达量

5 索拉非尼对多发性骨髓瘤(MM)细胞U266 VEGFR-3、PDGFR-β蛋白表达的影响

讨论

1 靶向药物索拉非尼目前研究的现状

2 索拉非尼作为新型的肿瘤靶向治疗药物潜在机制

3 索拉非尼与Raf-MEK-ERK信号传导通路的关系

4 索拉非尼对VEGFR／PDGFR的作用

5 索拉非尼作用删细胞株U266研究结果及分析

结论

参考文献

综述

主要缩写词表

在读期间发表的主要学术论文

致谢

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