细胞质雄性不育辣椒花粉败育的转录组学研究

摘要

辣椒是一种非常重要的蔬菜作物，利用辣椒细胞质雄性不育是进行其品种改良的重要方式之一。辣椒细胞质雄性不育系8214A具有高配合力、100％不育和优良的经济性状等特性而被广泛用于辣椒杂交制种，然而，其雄性不育机理尚不十分清楚。本研究对辣椒细胞质雄性不育系8214A及其相应的保持系8214B的花药发育的差异进行了细胞学比较研究，组织切片光学显微镜观察显示，细胞质雄性不育系8214A在减数分裂结束后完全败育。为了进一步阐明花粉败育的时期和原因，使用透射电子显微镜研究保持系和CMS系的花药中小孢子发生和绒毡层发育的差异。结果表明，与可育的保持系8214B比较，细胞质雄性不育系8214A的小孢子母细胞在减数分裂Ⅰ前期最早出现染色质穿壁异常并形成微核，与此同时，花药壁绒毡层细胞发生空泡化。随后，小孢子母细胞减数分裂不同步，在同一药室内出现不同发育时期的花粉母细胞，甚至小部分小孢子母细胞提前退化，呈现出典型的PCD细胞学特征，如染色质凝集固缩，细胞质收缩，细胞器空泡化等，大部分小孢子母细胞能完成减数分裂，形成异常的非四面体形的四分体，四分体小孢子大小不均一细胞核分配不均。花药壁的绒毡层细胞在减数分裂Ⅰ前期后发生未成熟PCD反应。最终，异常四分体和绒毡层细胞均在原位降解退化，异常四分体不能继续发育形成有功能的花粉。因此，辣椒细胞质雄性不育系8214A花粉败育是以小孢子母细胞自身PCD的形式进行的，绒毡层细胞未成熟PCD与花粉败育密切相关。显然，辣椒细胞质雄性不育系8214A花粉败育的方式不同于大多数由于绒毡层细胞异常引起的细胞质雄性不育。为了进一步揭示辣椒细胞质雄性不育系8214A花粉败育的基本的分子机制，采用高通量测序技术Illumina HiSeqTM PE150对细胞质雄性不育系8214A及其相应的保持系8214B花药减数分裂过程中的基因表达进行比较转录学分析，结果表明，在8214A和8214B的花药中分别得到clean reads162107002和151227618，并预测新转录本6165个;以8214A相比8214B基因|log2S/F|≥0.6和Pval＜0.05作为决定基因显著差异表达的域值，共获得1355个差异表达基因，包括显著上调基因424个和显著下调基因931个(8214A vs8214B，SvsF);随机挑选20个差异基因（11个下调基因和9个上调基因），用qRT-PCR方法验证了，这些基因的表达量与转录组结果有相同趋势，且RNA-seq与qRT-PCR数据呈明显的正相关(R2=0.9587)，因此转录组数据是高度可靠的;差异表达基因的GO富集分析显示，细胞质雄性不育系8214A中的泛素化连接酶基因和细胞周期停滞与负调控有关基因明显被抑制，两甲基转移酶基因的活性被激活，这些基因参与小孢子母细胞减数分裂过程中的DNA损伤修复与细胞死亡和细胞周期调控紧密相关，与细胞学研究结果相吻合，从而被认为是与细胞质雄性不育系8214A花粉败育过程中PCD相关基因。

目录

摘要

1 文献综述

1．1 细胞质雄性不育机理研究进展

1．1．1 植物雄性不育的类型

1．1．2 细胞质雄性不育的细胞学研究

1．1．3 细胞质雄性不育的分子水平研究

1．2 程序性死亡细胞与CMS

1．2．1 绒毡层结构变化

1．2．2 绒毡层特异性基因表达

1．3 辣椒细胞质雄性不育机理研究进展

1．4 本研究的目的与意义

2 细胞质雄性不育辣椒花粉败育的细胞学研究

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验设备

2．1．3 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 石蜡切片制作

2．2．2 超薄切片制作

2．3 结果与分析

2．3．1 辣椒CMS系8214A与相应保持系8214B花器官形态学差异

2．3．2 细胞质雄性不育系8214A与相应保持系8214B花药发育的组织学结构差异

2．3．3 细胞质雄性不育系8214A与相应保持系8214B花药发育的超微结构差异

2．4 讨论

2．4．1 花粉败育的模式

2．4．2 绒毡层和花粉败育

图版及图版说明

3 细胞质雄性不育辣椒花药减数分裂过程中转录组测序分析

3．1 实验材料

3．2 实验试剂与仪器

3．3 实验方法

3．3．1 辣椒花药总RNA提取

3．3．2 cDNA文库构建和Illumina测序

3．3．3 cDNA合成

3．3．4 荧光定量PCR

3．3．5 差异基因GO富集分析

3．4 实验结果与分析

3．4．1 测序数据的生物信息学分析

3．4．2 基因表达分析

3．4．3 CMS系和相应保持系花药减数分裂过程中差异表达基因筛选

3．4．4 qRT-PCR验证结果

3．4．5 泛素化连接酶和细胞周期相关基因参与8214A减数分裂期间MMCs的PCD调节

3．4．6 甲基转移酶基因涉及8214A减数分裂期间MMCs的PCD调节

3．5 讨论

3．5．1 泛素化连接酶与CMS花粉败育

3．5．2 甲基化与CMS花粉败育

4 结论

4．1 自身PCD导致辣椒CMS系花粉败育

4．2 泛素连接酶和细胞周期相关基因被抑制与辣椒CMS密切相关

4．3 甲基转移酶基因被激活与辣椒CMS密切相关

参考文献

硕士期间撰写、发表与课题相关的科研成果和学术论文

致谢

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