四环素调控CGRP基因表达的腺相关病毒的构建及鉴定

摘要

目的: 目前原发性高血压基因治疗有降低基因表达和诱导基因表达两种策略，本研究通过基因工程分子技术构建含有CGRP基因的重组腺相关病毒载体。为研究CGRP在自发性高血压大鼠体内过表达的降压和靶器官保护效果做准备。构建含有四环素（Tetracycline，Tet）诱导调控降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide，CGRP）表达的重组腺相关病毒质粒，并包装9型重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated viral vector9，rAAV9)，将其体外转染原代心肌细胞，观察重组腺相关病毒介导CGRP基因在原代心肌细胞中的表达。 方法: 1.pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒的构建 以pAAV-TRE-CMV-tTS/rtTA为模版，PCR扩增并插入双酶切(Ba-mHI、ApaLI)和引入Myc尾的CGRP-Myc片段，再将双酶切后的片段连接构成重组腺相关病毒质粒pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA。 2.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒的包装与鉴定 将pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒与pAA-V9包装质粒、辅助质粒pHelper共同转染HEK293细胞，获得rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒。用SDS-PAGE测定病毒纯度和q-PCR法测定病毒滴度。 3.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒表达的检测 将重组腺相关病毒rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA体外转染乳鼠原代心肌细胞，并在细胞培养液中加入Dox诱导CGRP表达，提取mRNA和蛋白质，用RT-PCR法和WesternBlot法测定CGRP基因的表达水平。 结果: 1.成功构建pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒。 2.成功包装rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒，病毒滴度为1.87×1012GC/mL。 3.rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒成功转染原代心肌细胞，并在Dox诱导下介导CGRP基因高表达。 结论: 成功构建pAAV-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒质粒，并包装和鉴定rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒。rAAV9-TRE-CGRP-Myc-tTS/rtTA重组腺相关病毒成功转染原代心肌细胞并在Dox诱导下介导CGRP基因高表达。

目录

摘要

第一章引言

2．1材料

2．2方法

3．1重组质粒的构建

3．2病毒的电镜分析

3．3病毒纯度检测

3．4病毒滴度测定

3．5 rAAV转染原代心肌细胞的检查

3．6 CGRP基因mRNA表达水平检测

3．7 CGRP蛋白量检测

第四章讨论

第五章结论

参考文献

综述 CGRP在心脑血管疾病中的应用

主要缩写词表

在读期间发表的主要学术论文及参与课题

致谢

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