过氧化氢等活性氧的荧光素衍生物探针研究

摘要

合理设计荧光素的衍生物分子，对于提高分析检测的灵敏度和选择性具有重要的意义。本文在查阅大量文献的基础上参考前人工作，结合荧光素分子的特殊结构，制备了多种荧光素衍生物，将之用于活性氧的检测，并且在此基础上初步构建了基于葡萄糖氧化酶（GOD）催化体系的免疫分析。具体内容包括以下方面： 第一部分：利用Suzuki催化偶联反应的原理，设计了新的3′,6′-对戊酰硼荧光素探针的合成路线。本实验研究了反应时间、溶剂、碱性强度、催化剂等因素对反应产率的影响。实验结果表明，该合成路线具有成本低廉，产率相对较高的优点。同时还检测了探针对H2O2的荧光响应，实验结果表明该探针具有灵敏度高，检测速度快等优点，在2.3×10-12 - 2.0×10-8 mol/L H2O2 溶液范围内，探针的荧光发射呈逐渐增强趋势，检测下限为2.3×10-12 mol/L。其非氧化荧光增强机理有助于在生物体系的H2O2 检测中避免其他氧化性物质的干扰。 第二部分：本实验初步发展了基于GOD催化体系的新型荧光免疫方法用于检测癌症标志物胸苷激酶（TK）。采用竞争免疫分析方法，将标记了生物素的TK与固定在醋酸纤维膜上的TK 抗体进行免疫反应，通过生物素和亲和素的特异性结合将生物素标记的GOD 固定在抗原上进行免疫放大，以3′,6′-对戊酰硼荧光素为荧光底物，通过检测GOD和葡萄糖作用产生的H2O2实现了TK 的快速测定。 结果表明，在抗体固定量为200 ng/mL时，生物素标记的TK在竞争免疫方法下检测浓度可以达到0.5 ng/mL，我们认为该方法对TK的检测简单易行，在短时间内有较好的荧光响应，灵敏度较高，有望能发展出基于GOD催化体系的TK免疫检测方法。 第三部分：合成出了一系列的荧光素酯化衍生物：荧光素对苯磺酸酯、荧光素对苯甲酸酯、荧光素对苯磷酸酯、呫吨酮对磷酸酯，考察了这四种物质在H2O2、O2<'- >和HO等活性氧物质下的荧光响应特性，并对荧光素衍生物的响应机理进行了探讨。荧光素对苯磺酸酯在H2O2、O2<'->和SOD 以及O2<'-> 作用下有荧光增强。呫吨酮对磷酸酯在H2O2 以及Fe2+作用下亦有显著的荧光增强效果。荧光素对苯甲酸酯、荧光素对苯磷酸酯在这些物质的作用下无荧光增强效果。