核酸探针与核酸酶结合在分析检测中的应用

摘要

核酸探针易于合成、稳定性好、设计简单、信号机制灵活,已广泛应用于生物学、医学和化学等领域。核酸探针与核酸酶结合可以形成多种灵活的分子识别信号转换机制,不仅可以实现高灵敏、高特异性检测,还用于生物分子相互作用的实时、动态监测。基于此,本文把核酸探针与核酸酶相结合应用于分析检测中,利用核酸探针灵活的信号机制和核酸酶的特异性,具体开展了以下3个方面的工作:
　　 1.基于双链探针和核酸外切酶Ⅰ,发展了一种放大检测小分子的新方法。核酸外切酶Ⅰ只特异性从3’→5’切割DNA单链。首先构建抗核酸外切酶Ⅰ的核酸适体-cDNA双链探针,当有腺苷存在时,通过竞争反应,腺苷与核酸适体结合,双链荧光探针被打开,核酸外切酶Ⅰ可以水解核酸适体和互补DNA暴露的3’-OH端,释放出来的腺苷继续结合另一条核酸适体探针,如此循环,荧光信号不断增强。通过检测酶切反应初速度,实现了小分子腺苷简单、快速的检测。该方法利用没有序列特异性的核酸外切酶Ⅰ进行放大,序列设计简单,对腺苷的检测具有良好的特异性和灵敏度,检测下限为0.65μM,比传统核酸适体双链探针方法的检测下限(26μM)降低了两个数量级,有望发展为一种设计简单、通用的小分子放大检测的方法。
　　 2.基于带AP位点的分子信标,发展了一种APE1酶活性分析的新方法。APE1可以切割带AP位点的DNA。设计了两条分子信标,一条为臂部双链区带有一个AP位点的长臂分子信标(P1),另一条为环部单链区带有一个AP位点的常规分子信标(P2)。把它们作为APE1酶底物,比较了二者的性能。通过检测酶切初速度,用性能更好的P1探针对APE1酶活性进行了分析。该方法结合了APE1的特性和分子信标灵活的信号机制,设计简单,APE1酶的检测下限为0.25 U/mL,线性范围为0.25-50 U/mL,是一种简单的APE1酶活性的分析方法。
　　 3.基于分子信标和S1核酸酶发展了一种检测锌离子的新方法。S1核酸酶是一种单链核酸内切酶,其酶切速度对锌离子有很强的依赖性。使用分子信标作为S1核酸酶的底物,通过检测不同锌离子浓度下酶切初速度的变化,实现了对锌离子简便、快速的检测。该方法利用S1核酸酶的特性和分子信标灵活的信号机制,避免了复杂离子载体的合成,操作简单,对锌离子的检测下限达到120μM。

目录

文摘

英文文摘

本文所用英文缩写词表

第1章 绪论

1.1 几种典型的核酸探针

1.1.1 TaqMan探针

1.1.2 Padlock探针

1.1.3 相邻探针

1.1.4 阴阳探针

1.1.5 分子信标

1.1.6 核酸适体探针

1.2 核酸探针与核酸酶结合在分析检测中的应用

1.2.1 提高检测灵敏度的典型方法

1.2.2 提高检测特异性的典型方法

1.2.3 实现实时监测的典型方法

1.3 本文拟开展的研究工作

第2章 核酸适体双链探针和核酸外切酶I放大检测小分子的研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 主要仪器和试剂

2.2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 检测原理

2.3.2 可行性验证

2.3.3 检测条件的选择

2.3.4 腺苷的定量检测

2.3.5 方法的特异性考察

2.4 小结

第3章 分子信标对APE1酶活性分析的研究

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 主要仪器和试剂

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 检测原理

3.3.2 可行性验证

3.3.3 两种分子信标的性能比较

3.3.4 探针P1热稳定性的考察

3.3.5 APE1酶的定量检测

3.4 小结

第4章 分子信标和S1核酸酶检测锌离子的研究

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 主要仪器和试剂

4.2.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 检测原理

4.3.2 可行性验证

4.3.3 Na+浓度的选择

4.3.4 S1核酸酶浓度的选择

4.3.5 分子信标浓度的选择

4.3.6 锌离子的定量检测

4.4 小结

结论

参考文献

附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢