基于发夹探针基因突变点分析与DNA修饰检测小分子

摘要

单碱基多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)是遗传变异中最丰富的形式,人类30亿碱基当中每100-300个碱基就可能出现一次单碱基突变。实现对这些基因单碱基突变的早期、准确、简便、快速的确认,对于很多疾病的发病机理研究及早期诊断治疗非常重要。因此开发一些易于操作、价格低廉且又精确有效的DNA传感技术意义重大。
　　 发夹型核酸探针由于具有灵敏度高,特异性好等优点已经被广泛应用于生物传感器的制备。近年来,科学家们通过改变经典分子信标的结构,已提出了许多新型的检测方法。本文中,我们通过对发夹探针的重新设计,发展了两种新颖的DNA传感技术。此外,我们通过DNA修饰转换信号,实现了对小分子目标物的灵敏检测。主要内容如下:
　　 (1)巧妙设计了一条植入酶切位点的具有发夹结构的寡聚核苷酸链,实现了一种简单、有效的DNA压电检测方法。其特点在于结合使用核酸内切酶(ECoR I)及纳米金标记的检测探针,能够很好的降低背景值并有效增强信号。方案如下:在电极表面固定具有酶切位点的发夹探针,当待测体系中含有目标DNA时,发夹探针可以通过与目标链杂交打开,导致内切酶对其没有作用,从而实现纳米金沉积放大作用;反之,在没有目标链时,发夹探针被特异性酶切,无法继续反应,便没有信号产生。实验结果表明,此方法是一种简单实用、选择性高、灵敏度较高的适用于DNA分析检测的技术。此外,通过共用ECoRⅠ和目标序列,我们还设计了一种用亚甲基蓝作指示剂的电化学方法,进一步验证了我们实验体系的实用性,为基因突变点分析提供了一种新的思路。
　　 (2)提出了一种单步可重复的检测DNA单碱基突变的电化学分子开关。实验中采用了一条标记二茂铁的具有发央结构的寡聚核苷酸链,当与目标链杂交打开发夹后被修饰有捕获探针的电极捕获从而拉近电活性物质二茂铁产生很强的电流信号,成功构建了一种信号打开型的电化学传感器。这一方法在基因突变导致α-地贫的分析检测中得到了实际应用,成功检测了染色体末端142编码子(HbConstant Spring codon142)单碱基突变(TAA→CAA)的存在,取得了令人满意的实验结果。检测下限为0.01 pM,在0.01到100 pM的目标DNA浓度范围里面,电流信号与目标物浓度对数呈现良好的线性关系,结果表明,此方法是一种简单快速而且比较灵敏的适用于单碱基突变检测的技术,具有较强的通用性。
　　 (3)实现了一种基于DNA修饰的小分子目标物检测方法,该法应用了一条修饰了目标小分子的巯基化的杂交链,当加入含有目标物β-吲哚乙酸(IAA)的样品预先反应一段时间后,样品中的游离IAA可以跟反应液中的IAA抗体蛋白相结合,从而阻碍后续反应抗体与衍生的IAA的结合,于是巯基化的衍生链可以自组装到石英晶振(QCM)表面,接下来通过杂交反应和生物素-亲和素作用引入辣根过氧化酶,通过酶催化沉积作用产生增强的压电信号响应。此方法不仅比传统的方法更有效灵敏地监测了IAA与抗体的结合作用以及定量分析IAA,而且这个新颖的理念为我们以后检测其他的小分子提供了一个新的平台。实验结果表明,此方法是一种价格低廉、选择性高、灵敏度高的适用于小分子目标物分析检测的技术。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪论

1.1 生物传感器

1.2 压电DNA传感器

1.2.1 压电分析理论基础

1.2.2 压电传感信号放大技术

1.2.3 压电DNA传感器的发展与应用

1.3 电化学DNA传感器

1.3.1 电化学DNA传感器原理

1.3.2 电化学DNA传感器的分类与应用

1.4 发夹型核酸探针的设计

1.5 本文研究构想

第2章 基于发夹分子与核酸内切酶技术的基因突变点分析方法

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂与仪器

2.2.2 石英晶振表面修饰

2.2.3 纳米金标记检测探针

2.2.4 分析检测步骤

2.3 结果与讨论

2.3.1 发夹状探针的设计

2.3.2 电化学阻抗表征

2.3.3 纳米金标记检测探针的信号扩增作用

2.3.4 实验条件优化

2.3.5 分析结果与选择性考察

2.3.6 电化学方法检测结果讨论

2.4 小结

第3章 基于电化学分子开关的单步可重复检测DNA单碱基突变技术

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 二茂铁标记信标分子

3.2.3 传感界而的制备

3.2.4 检测步骤

3.3 结果与讨论

3.3.1 传感器构建与探针设计

3.3.2 阻抗表征

3.3.3 实验条件优化

3.3.4 电化学信号响应特征

3.3.5 校准曲线

3.3.6 传感器再生

3.4 小结

第4章 基于DNA修饰的压电小分子检测方法

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂与仪器

4.2.2 石英晶体表面修饰

4.2.3 IAA标记识别探针

4.2.4 分析检测步骤

4.3 结果与讨论

4.3.1 电化学阻抗表征

4.3.2 传感器频率响应特征

4.3.3 校准曲线

4.3.4 选择性考察与回收实验

4.3.5 传感体系的特点

4.4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读硕士学位期间所发表的学术论文

致谢