新型双功能铕螯合物在时间分辨荧光免疫分析中的应用研究

摘要

近年来分析生物化学及医学领域一直致力于研发操作简单、灵敏度高、特异性强的量化分析及检测方法。其中时间分辨荧光免疫法(TRFIA)近年来发展得十分迅速,它具备灵敏度高,便于自动化操作,不易受基体干扰,可以同时实现多标记等优点,这些优势使其在众多免疫方法中逐渐占据重要地位。与传统的荧光素标记不同,TRFIA充分利用了稀土元素配合物这类荧光物质荧光寿命长及Stokes位移大的特点,有效地克服短寿命的背景荧光对测定的干扰,使非特异性本底信号降低到可以忽略的程度,达到了很高的信噪比。其中固相TRFIA是新一代的TRFIA方法,它克服了原来的液相TRFIA需要增强液、易受环境Eu3+污染等缺点,简化了测量步骤,提高了测量灵敏度。
　　 在此次研究中,作者首先运用一种新型双功能螯合物Eu(TTA)3(5-NH2-phen)(ETNP)用来标记羊抗人IgG建立了一种新的固相双抗体夹心免疫法。这种新型的螯合物具备强荧光、长寿命等特点,与羊抗人IgG结合后不易解离,可直接在固相玻片上检测到较强的荧光信号。固相双抗体夹心法操作简单,其最终复合物可直接在玻片上进行检测。由荧光仪检测得出的荧光信号强度与抗原浓度成正比,因此也可以运用此方法作为定量分析的依据。实验证明,运用ETNP作为标记物而建立起来的固相荧光免疫方法最低可检测到5μg/L,而RIA最低检测限仅为800～1000μ g/L,ELISA最低只能检测到200μ g/L。这是该新型荧光标记物ETNP第一次运用于固相时间分辨荧光免疫分析方法中抗原抗体的定性定量分析,该方法具有操作简单,检测限低、高灵敏度等特点。然后,在人IgG检测体系确定的基础上,作者还利用同样的实验体系及这种双功能螫合物检测甲胎蛋自AFP进行定量检测,取得的较好的结果,最低可检测到22μg/L,重复性良好。
　　 通过此次实验体系证明运用新型双功能标记物ETNP建立起来的固相时间分辨体系在抗原抗体检测中具有是一种具有巨大潜力,可以应用于临床医学、生物化学分析等多种领域。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:图表目录

第1章 绪论

1.1 免疫体系概述

1.1.1 抗体的性质和结构

1.1.2 抗原的性质与结构

1.1.3 抗体-抗原反应的原理

1.1.4 抗体-抗原反应的主要影响因素

1.1.5 免疫分析的形式和原理

1.2 常用标记免疫分析技术现状

1.2.1 荧光免疫分析法

1.2.2 放射免疫分析法

1.2.3 酶免疫分析法

1.2.4 化学发光及新型电化学免疫分析法

1.2.5 时间分辨荧光免疫分析法

1.3 时间分辨荧光免疫技术

1.3.1 时间分辨荧光免疫分析的原理

1.3.2 溶解增强时间分辨荧光免疫分析法

1.3.3 直接标记镧系离子的固相时间分辨荧光免疫分析法

1.3.4 酶增幅时间分辨荧光免疫分析法

1.3.5 均相时间分辨荧光免疫分析法

1.4 稀土元素

1.4.1 稀土配合物的发光机理

1.4.2 稀土配合物的荧光发光特性

1.4.3 标记物的研究进展

1.5 国内外的发展情况

1.5.1 国外TRFIA发展历程

1.5.2 国内TRFIA发展历程及现状

1.6 时间分辨荧光免疫分析法在其他方面的应用

1.6.1 时间分辨荧光免疫技术应用于核酸检测

1.6.2 时间分辨荧光免疫技术应用于细胞活性分析

1.6.3 时间分辨荧光免疫技术在环境污染监测中的应用

1.6.4 时间分辨荧光免疫技术在激素及RAC残留物检测中的应用

1.7 当前研究课题的内容与意义

第2章 实验仪器和材料

2.1 材料和仪器

2.1.1 主要药品

2.1.2 实验仪器

2.1.3 稀土配合物Eu(TTA)3(5-NH2-phen)的合成

2.1.4 试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 玻片醛基化

2.2.2 固相抗体固定

2.2.3 用Eu3+标记物对第二抗体进行标记

2.2.4 分析程序

2.2.5 荧光强度的测定

第3章 时间分辨荧光免疫分析检测人IgG

3.1 研究背景及意义

3.2 实验结果与分析

3.2.1 ETNP螫合物荧光光谱和荧光寿命

3.2.2 不同浓度的戊二醛及不同反应时间对玻片结合力的影响

3.2.3 固相包被抗体浓度的选择

3.2.4 免疫反应时间

3.2.5 抗原人IgG浓度与荧光强度

3.2.6 荧光强度与人IgG浓度的线性关系

3.3 本章小结

第4章 TRFIA在甲胎蛋白AFP的定量检测中的应用

4.1 研究背景和意义

4.2 实验结果讨论

4.2.1 缓冲液pH值对蛋白质活性的影响

4.2.2 包被抗体浓度的选择

4.2.3 包被单抗A47与抗原AFP的反应时间

4.2.4 第二抗体A137与A47-AFP复合物的反应时间

4.2.5 荧光强度与待检的AFP抗原浓度的关系

4.3 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文

致谢