核酸分子探针结合信号放大技术用于核酸的检测

摘要

核酸的检测涉及到疾病诊断、基因筛查、环境检测等诸多领域,与人类健康、社会安定息息相关。传统的核酸检测方法灵敏度低、操作复杂、耗时费力。实现核酸的灵敏、精确、便捷、经济的检测已成为各个领域愈加迫切的要求。近年来发展起来的利用各种工具酶、纳米颗粒等手段的核酸信号放大检测技术为此提供了新的契机。本文将脱氧核酶与切刻内切酶相结合发展了3种信号放大方法用于核酸的检测,主要内容包括：
　　 ⑴基于脱氧核酶电化学信号放大检测DNA。设计新型核酸探针,建立了一种以脱氧核酶催化反应作为信号放大手段,以电化学计时电流法为检测手段的DNA检测新方法。这种结合了脱氧核酶的核酸探针无需经过电活性物质标记,与靶DNA杂交后释放出脱氧核酶,催化底物反应实现信号放大检测。该方法操作简便,无需复杂仪器、快速,特异性好,检测下限达到0.6 nmol/L。
　　 ⑵基于脱氧核酶和链置换聚合酶反应比色法信号放大检测miRNA。结合脱氧核酶与切刻酶介导的聚合酶链置换反应,发展了一种miRNA检测的新方法。当靶miRNA存在时,与嵌合探针杂交,并通过RNaseH作用,引发切刻反应-链置换聚合酶反应循环进行,不断产生脱氧核酶序列。这些序列具有类似于过氧化物酶的活性,可以催化底物发生颜色的变化,产生可检测信号。该方法不需变温、分离等复杂的操作步骤,方法简便,快捷,特异性较好,检测下限达到2 fmol/L。
　　 ⑶基于分子信标和链置换聚合酶反应荧光信号放大检测miRNA。设计了一条DNA与RNA嵌段的探针,作为靶miRNA的识别探针和链置换聚合反应的模板,利用RNaseH和切刻内切酶介导的链置换聚合酶反应,发展了一种等温循环放大的miRNA荧光检测新方法。该方法避免了常规核酸扩增检测方法易产生假阳性反应或容易导致污染的问题,不需分离等复杂的操作步骤,在等温下反应,方法快捷,特异性好,对靶miRNA检测下限为0.5 fmol/L。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:本文所用英文缩略词表

第1章 绪论

1.1 核酸检测的意义

1.2 核酸检测的主要方法

1.2.1 基于直接核酸杂交的检测方法

1.2.2 基于核酸体外扩增技术的核酸检测方法

1.3 核酸信号放大检测技术及其在核酸分析检测中的应用

1.3.1 基于切刻酶介导的链置换聚合酶反应信号放大检测

1.3.2 基于引物入侵技术的信号放大检测

1.3.3 基于脱氧核酶(DNAzyme)催化的信号放大检测

1.3.4 基于滚换扩增(RCA)的信号放大检测

1.4 本文拟开展的工作

第2章 基于脱氧核酶电化学信号放大检测DNA

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 检测原理

2.3.2 发夹形探针序列的筛选

2.3.3 G-四聚体复合物形成的电化学表征

2.3.4 可行性考察

2.3.5 实验条件的优化

2.3.6 DNA的定量检测

2.3.7 方法特异性考察

2.3.8 电极的再生

2.4 小结

第3章 基于脱氧核酶和链置换聚合酶反应比色法信号放大检测miRNA

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 检测原理

3.3.2 方法的可行性考察

3.3.3 DNA-RNA嵌合探针浓度的优化

3.3.4 miRNA的定量检测

3.3.4 方法特异性考察

3.4 小结

第4章 基于分子信标和链置换聚合酶反应荧光信号放大检测miRNA

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 检测原理

4.3.2 分子信标的设计和性能考察

4.3.3 方法可行性考察

4.3.3 嵌合探针的浓度优化

4.3.4 miRNA的定量检测

4.3.5 方法特异性考察

4.4 小结

结论

参考文献

附录 攻读硕士学位期间所发表的学术论文及专利

致谢