基于酶信号放大的新型无标记核酸生物传感方法研究

摘要

随着生命科学的快速发展，对生命体中发挥重要作用的生物分子进行分析检测有重要意义，尤其在疾病的早期诊断，预防，治疗等方面。生物传感技术作为分析化学学科中的一种前沿的新型分析技术，具有灵敏度高、选择性好、成本较低、分析速度快以及能够进行连续监测等优点，在生命科学，临床医学，分子生物学等领域得到广泛的应用。随着生物化学的进一步发展，DNA不再仅仅作为生物体遗传信息的携带者而被熟知，它的更多化学及生物电子学性质被更加广泛和深入地研究，如今DNA已发展成为了新型感应材料，催化剂，药物等。
　　 本研究论文综合文献报道，利用酶信号放大技术，结合DNA的生物识别和催化功能，致力于提高检测灵敏度，线性响应范围，简化实验过程，控制实验成本等几方面，发展了几种新型的无标记DNA传感方法，对几种重要的生物分子进行了特异性好，灵敏度高的分析检测，工作主要内容如下:
　　 (1)构建了一种基于PCR核酸扩增，甲基化敏感的限制性内切酶酶切和编码蛋白DNA的体外表达的新型传感策略，实现了对DNA甲基转移酶的灵敏检测，检测下限达0.08 U/mL，化学发光强度与0.2 U/mL-100 U/mL的DNA甲基转移酶间存在线性关系。该方法特点在于通过PCR扩增获得的无标记的线性双链DNA，既是DNA甲基转移酶和甲基化敏感的限制性内切酶的识别和作用底物，同时由于其具有启动子序列和荧光素酶编码序列，也是体外表达荧光素酶的模板。只有在甲基化位点保持完整的情况下，模板DNA才能顺利进行体外的转录/翻译过程，表达产物荧光素酶催化荧光素氧化发光。（第二章）
　　 (2)基于5'端磷酸化的双链DNA能被Lamda核酸外切酶优先识别并酶切，设计了一个简单的无标记的发夹DNA探针作为反应平台，实现了对T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)的检测。通过PNK和lamda核酸外切酶的共同作用实现对发夹探针中DNAzyme的调控，并利用释放的DNAzyme与氯化高铁血红素(Hemin)结合催化2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS2-)的显色反应，实现了对PNK的简单，快速，可视化的灵敏检测，并对其抑制剂的筛选进行了相应考查。该分析方法对PNK的检测下限达0.06 U/mL，在0.06-100 U/mL之间，紫外-可见吸收光强度的增值与PNK浓度的对数呈线性相关。（第三章）
　　 (3)利用等温循环链置换反应，对目标分子和信号分子进行同步放大，实现了对MicroRNA的简单检测，检测下限达0.5 fM，在0.5 fM-1 nM的目标物间，紫外-可见吸光强度与目标物浓度的对数呈现出线性相关。基于DNA探针在目标物的存在下发生构象改变，设计了一个无任何标记的DNA发夹探针，该探针被目标物打开后作为循环链置换反应的模板。核酸切刻内切酶在探针的两个切刻位点处进行切刻，产生一种核酸片段作为目标类似物继续打开其他探针，另一种核酸片段作为信号分子随反应累积，与Hemin形成复合物，ABTS2-氧化得到绿色产物，通过测定吸收光谱对目标分子进行定量分析。（第四章）

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 生物传感器

1．1．1 生物传感器介绍

1．1．2 生物传感器的应用

1．2 光学DNA传感器

1．2．1 荧光分析法

1．2．2 紫外-可见光分析法

1．2．3 生物发光分析法

1．3 酶信号放大技术

1．3．1 聚合酶扩增放大

1．3．2 核酸酶切放大

1．3．3 DNAzyme放大

1．4 非标记的DNA光学传感器

1．5 本文研究构想

第2章 基于甲基化敏感的限制性内切酶的生物发光方法用于DNA甲基转移酶活性的检测

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 PCR获得线性DNA模板

2．2．3 甲基化作用及限制性酶切过程

2．2．4 荧光素酶报告基因的体外表达

2．2．5 生物发光检测

2．2．6 琼脂糖凝胶电泳

2．2．7 Dam甲基转移酶抑制剂分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验设计原理

2．3．2 实验可行性分析

2．3．3 电泳分析

2．3．4 体外表达时间的优化

2．3．5 Dam甲基化酶活性的检测

2．3．6 抑制剂的考查

2．4 小结

第3章 HRP-DNAzyme和Lamda核酸外切酶用于T4多聚核苷酸激酶的可视化研究

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 识别DNA探针设计

3．2．3 实验过程

3．2．4 嵌入核酸染料的荧光光谱表征

3．2．5 抑制剂分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 实验原理及其验证

3．3．2 实验条件的优化

3．3．3 T4多聚核苷酸激酶的定量分析

3．3．4 抑制剂的考查

3．4 小结

第4章 基于目标物放大和DNAzyme的简单比色方法用于MicroRNA的分析检测

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与仪器

4．2．2 识别发夹探针的设计

4．2．3 实验过程

4．3 结果与讨论

4．3．1 实验原理及可行性分析

4．3．2 实验条件的优化

4．3．3 目标MicroRNA的定量检测

4．3．4 错配分析

4．3．5 复杂体系分析

4．4 小结

结论

参考文献

附录A LR-DNA的具体序列

附录B 攻读硕士学位期间所发表的学术论文

致谢