重金属镉诱导下白腐真菌胞外培养液蛋白的提取及分析研究

摘要

白腐真菌能够有效地吸附废水中的重金属，但在去除重金属的同时需抵御重金属对自身的毒害。蛋白质参与了细胞代谢、增殖、转录、信号传导等众多生命活动，并且白腐真菌胞外培养液蛋白与重金属结晶的形成密切相关，从蛋白质水平上分析能够进一步了解白腐真菌对重金属毒害的调节机制及与重金属之间的相互作用。目前有关胞外培养液中蛋白质的变化与重金属诱导的关系还未有详细研究。本论文考察了白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)在Cd(Ⅱ)诱导下合适的培养液蛋白提取时间，并对差异蛋白沉淀提取、双向电泳分离和质谱鉴定，最后搜库比对得到鉴定成功的蛋白，结合蛋白的功能分析黄孢原毛平革菌对Cd(Ⅱ)毒害的调节机制。
　　 通过考察黄孢原毛平革菌在对数生长期50～70h内对Cd(Ⅱ)的去除情况，发现在65h时对重金属Cd(Ⅱ)有最大吸附量为77.14 mg/g，而且黄孢原毛平革菌培养液中蛋白质在60～70h的时间段内含量较多，因此选取65h作为蛋白质的提取时间，此时Cd(Ⅱ)吸附量最大，更能直接有效地反映黄孢原毛平革菌与重金属之间的相互作用。
　　 通过单相电泳(SDS-PAGE)实验发现，Cd(Ⅱ)诱导使黄孢原毛平革菌分子量在26.0 KDa～33.0 KDa区间内的培养液蛋白产生了变化，某些蛋白的表达量上升，采用二维差异荧光凝胶电泳(2D-DIGE)得到了17个Cd(Ⅱ)诱导下差异蛋白点，其中一小部分比较密集的点也集中在分子量26.0KDa～33.0 KDa，这个分子量区间内的蛋白可能在调节重金属毒害及重金属吸附方面有着重要作用。
　　 利用串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)成功鉴定出了3种蛋白，分别为苹果酸脱氢酶(MDH)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)，其中MDH和GAPDH在Cd(Ⅱ)诱导后表达量下调，而GST在Cd(Ⅱ)诱导后表达量上调。三种蛋白的分子量分别为35KDa、15KDa和31KDa，在许多微生物体中与重金属的氧化应激有关，是微生物体内有着重要作用的酶。重金属镉从一定程度上抑制了黄孢原毛平革菌的生长，减少了GAPDH和MDH的向外运输。虽然Cd(Ⅱ)不是氧化还原活性金属离子，但却能引起黄孢原毛平革菌产生氧化胁迫导致废水中抗氧化酶的变化。以上研究表明镉诱导下的氧化应激可以通过GST、GAPDH和MDH酶来进行调节，抗氧化的调节机制很可能是黄孢原毛平革菌解除重金属Cd(Ⅱ)毒害的关键，特别是胞内的抗氧化调节。此研究为深入了解白腐真菌对重金属Cd(Ⅱ)的解毒机制提供了一定的参考价值。

目录

声明

摘要

插图索引

附表索引

第1章 绪论

1．1 重金属废水污染概述

1．1．1 重金属废水污染的特点

1．1．2 我国重金属废水污染现状

1．1．3 重金属污染的毒害

1．1．4 重金属废水的处理特点

1．2 微生物处理重金属废水

1．2．1 微生物处理法的定义

1．2．2 微生物处理重金属废水的机理

1．2．3 常用的微生物处理法

1．2．4 微生物处理法与其他方法的比较

1．3 白腐真菌与重金属废水的治理

1．3．1 白腐真菌对重金属的吸附

1．3．2 重金属对白腐真菌的影响

1．4 白腐真菌蛋白质及电泳分析

1．4．1 蛋白质的相关分析

1．4．2 蛋白质样品的制备

1．4．3 蛋白质电泳分析

1．4．4 生物质谱技术和蛋白质鉴定

1．5 本课题的研究内容和意义

第2章 白腐真菌对Cd(Ⅱ)的吸附及培养液中蛋白的提取

2．1 实验主要仪器和试剂

2．1．1 实验主要仪器

2．1．2 实验主要试剂及其制备

2．2 实验材料

2．2．1 菌种

2．2．2 菌种的传代培养

2．2．3 菌丝球的培养

2．3 Cd(Ⅱ)浓度的测定

2．4 实验方法

2．4．1 Cd(Ⅱ)的吸附实验

2．4．2 溶液pH值的测定

2．4．3 Bradford法测定蛋白质含量

2．4．4 培养液中蛋白质的提取

2．5 结果与讨论

2．5．1 Cd(Ⅱ)的吸附实验

2．5．2 溶液pH值的变化

2．5．3 蛋白质含量的变化

2．6 结论

第3章 Cd(Ⅱ)诱导白腐真菌培养液蛋白的单向及双向电泳

3．1 实验主要仪器和试剂

3．1．1 实验主要仪器

3．1．2 单向电泳实验主要试剂及其制备

3．1．3 双向电泳实验主要试剂及其制备

3．2 实验材料

3．2．1 菌种

3．2．2 菌丝球的培养

3．2．3 蛋白样品的制备

3．3 实验方法

3．3．1 单相电泳凝胶的配制

3．3．2 单相电泳凝胶的染色及褪色

3．3．3 双向电泳样品的前处理

3．3．4 双向电泳试剂盒测定蛋白质含量

3．3．5 双向电泳样品染色标记处理

3．3．6 双向电泳的第一向电泳

3．3．7 双向电泳的第二向电泳

3．3．8 双向电泳胶条的平衡和转移

3．3．9 双向电泳凝胶固定、染色和脱色

3．4 结果与讨论

3．4．1 单向电泳的实验结果

3．4．2 双向电泳的实验结果

3．5 结论

第4章 Cd(Ⅱ)诱导白腐真菌培养液蛋白的质谱鉴定

4．1 实验主要仪器和试剂

4．1．1 实验主要仪器

4．1．2 实验主要试剂及其制备

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 蛋白点的酶解

4．3．2 MALDI-TOF／TOF质谱鉴定

4．4 结果与讨论

4．5 结论

结论

1 研究结论

2 研究展望

参考文献

致谢

附录A 攻读硕士学位期间所发表的学术论文目录

附录B 攻读硕士学位期间所申请的国家发明专利目录