基于目标物介导SERS纳米粒子自组装的新型生物传感方法

摘要

随着对基础理论研究的不断深入和纳米材料构建技术的飞速发展,表面增强拉曼光谱(SERS)技术在生物学、医学、材料科学以及环境科学等领域中所扮演的角色也越来越重要。相对于其它几种光学检测手段,SERS技术具有独特的优势,超高的灵敏度、丰富的光谱信息、窄的发射谱带、所需样品量小以及无需样品预处理等。本论文以具有重要生物功能和研究意义以及重大疾病相关的生物标志物(如蛋白质、酶、毒素等)为研究对象,发展了一系列简单、快速、成本低、稳定性好,且具有高灵敏度和高选择性的新型生物传感方法。研究论文的主要内容概括如下:
　　(1)DNA去甲基化酶的失调会引起多种神经退行性疾病、免疫系统疾病以及癌症。第二章中,发展了一种基于酶介导等离子体共振耦合以及SERS信号传导的DNA去甲基化检测方法。该方法设计了一条包含限制性内切酶识别序列(酶切位点处的胞嘧啶进行甲基化修饰)的发夹型底物探针,并制备了底物探针功能化的SERS活性纳米颗粒。激活的DNA去甲基化酶使甲基化的底物探针发生去甲基化作用,从而对甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶切割和降解底物探针,导致金纳米颗粒形成聚集体,产生等离子体共振耦合效应,显著增强了颗粒表面吸附拉曼染料的SERS信号。目前来看,我们首次报道了关于酶介导等离子体共振耦合效应的产生来获得可重现的SERS增强。该方法简单、快速、只需一步均相反应、稳定性好、易于实现高通量检测,且具有非常高的灵敏度和选择性,为DNA去甲基化研究和相关的分子诊断、药物筛选提供了一个简单而有用的新方法。
　　(2)高灵敏的生物标志物检测对于蛋白组学和临床诊断具有重要的意义。第三章中,发展了一种基于目标物介导SERS活性纳米粒子自组装的多组分均相免疫分析方法。该方法利用抗原抗体免疫夹心原理,使两种不同形状的SERS活性纳米粒子(拉曼染料和抗体半片段功能化的球形金纳米粒子和金纳米棒)自组装成有序聚集体,导致粒子间隙的局域电磁场显著增强,从而极大增强了粒子表面吸附拉曼染料的SERS信号。与传统的SERS活性纳米粒子制备方法不同的是,我们利用化学方法对抗体进行还原处理,使抗体可以通过Au-S键共价作用结合在金纳米粒子表面。通过这种方式,不仅实现了抗体在金纳米粒子表面的定向组装,使抗体具有一致的活性,同时,减小的抗体尺寸有效地缩短了纳米粒子之间的距离,能够使粒子间隙产生更大程度的表面等离子体共振耦合和更加显著的局域电磁场增强,并且,提高了SERS活性纳米粒子在复杂生物体系中的稳定性,有利于长期储存。文中,我们选择三种细胞因子,干扰素γ、白介素2和肿瘤坏死因子α作为模型体系,对方法的实用性进行了考察,均获得非常高的信背比和灵敏度。另外,我们筛选出几种非荧光型的拉曼染料,对多种目标蛋白逐一进行编码,实现了多目标物体系的同步分析。与传统的基于SERS活性纳米粒子的检测方法比较,该方法操作简单、易于掌握、无需借助于复杂的仪器和繁琐的洗脱步骤,检测时间短、只需一步均相反应、易于实现高通量检测,且具有较高的灵敏度和选择性。因此,该方法为疾病标志物的准确鉴定以及临床早期诊断建立了一个简单而有用的平台。
　　(3)灵敏、快速、低成本的霍乱毒素检测对于霍乱流行病的防疫、控制和治疗具有十分重要的意义。第四章中,我们发展了一种基于GM1功能化脂质体-SERS活性纳米颗粒复合物的霍乱毒素检测方法。通过使用特殊的磷脂成份,成功地制备出GM1功能化脂质体-SERS活性纳米颗粒复合物,制备方法简单、易于重复。利用神经节苷酯GM1分子与霍乱毒素分子之间的特异性作用,使纳米颗粒复合物自组装成聚集体,产生等离子体共振耦合效应,显著增强了颗粒间隙的局域电磁场强度,从而使颗粒表面吸附拉曼染料的SERS信号极大增强。与传统的霍乱毒素检测方法比较,该方法操作简单、便捷、只需一步均相反应、稳定性好,无需任何的生物分子标记和繁琐的洗脱步骤,且具有更高的灵敏度和更好的重现性,为霍乱毒素准确鉴定以及霍乱流行病早期诊断提供了一个有用的新方法。
　　(4)鉴定和识别组蛋白去甲基化酶对肿瘤等重大疾病的诊断、预防、预后判断以及药物研发都有重要的意义。第五章中,我们发展了一种高灵敏、高特异性的组蛋白去甲基化酶(HDMs)活性检测方法。该方法利用了一种甲醛选择性反应的活性探针,它能够与组蛋白去甲基化过程中生成的副产物甲醛发生加合反应,且加合产物能够通过巯基自组装方式结合到金纳米颗粒表面,释放出显著增强的SERS信号。据我们了解,这是首次关于甲醛选择性反应探针用于SERS检测组蛋白去甲基化酶活性的报道。与传统的HDMs检测方法相比,该方法操作简单、快速、稳定性好、不易受本底荧光的干扰、无需任何的生物分子标记和繁琐的洗脱步骤,且具有更高的灵敏度和信背比。因此,该方法为去甲基化酶的鉴定与识别以及去甲基化过程的分析研究建立了一个新的平台。

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第1章 绪 论

1.1 局域表面等离子体共振和等离子体共振耦合效应

1.2 表面增强拉曼光谱技术

1.3 表面增强拉曼光谱技术在生物传感和生化分析中的应用

1.4 本论文的研究构想

第2章 基于酶介导等离子体共振耦合及SERS信号传导的DNA去甲基化检测

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第3章 基于目标物介导SERS纳米粒子自组装的多组分均相免疫分析方法及其在复杂生物体系中的应用

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第4章 基于神经节苷酯GM1功能化脂质体-SERS活性纳米颗粒复合物的超灵敏的霍乱毒素检测

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 小结

第5章 甲醛选择性反应探针用于SERS检测组蛋白去甲基化酶活性

5.1 引言

5.2 实验部分

5.3 结果与讨论

5.4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢