基于超电荷绿色荧光蛋白及量子点的荧光传感新方法

摘要

现今，人类身体健康问题已成为全民关注的热点。而疾病的发生是威胁人类生命安全最主要的方面。研究表明疾病的发生与体内生物酶的不正常表达及某些重要营养元素含量的高低有关。人类许多重大疾病如癌症、遗传性疾病都与DNA甲基化以及甲基化酶的活性密切相关;85-90％癌症的发生都与端粒酶的活性有关。同时DNA甲基化酶和端粒酶可以作为早期癌症诊断的标志及肿瘤治疗的靶点。另外，抗坏血酸（维生素C）是一种对人类非常重要的营养元素，其含量高低常作为某些疾病诊断（如败血症）及营养分析的重要指标。因此实现DNA甲基化酶活性、端粒酶活性及抗坏血酸含量的灵敏检测具有非常重要的现实意义。基于此，本论文利用新型荧光纳米材料（荧光蛋白、量子点）独特的光学性质，开发了三种无标记的荧光分析方法分别用于DNA甲基化酶、端粒酶活性及抗坏血酸的检测，具体工作如下:
　　(1)基于超电荷绿色荧光蛋白(supercharged green fluorescent protein，scGFP)荧光和带正电荷的双重性质以及氧化石墨烯(GO)的荧光猝灭能力，开发了一种DNA甲基化酶及其抑制剂5-氟尿嘧啶的检测方法。scGFP可通过非共价结合力吸附在氧化石墨烯上，进而猝灭scGFP的荧光。而带负电的DNA能与scGFP结合，使scGFP聚集，从而保留scGFP的荧光不被氧化石墨烯猝灭。在此基础上，合理设计探针序列，该探针可发生Dam甲基化酶及限制性内切酶DpnⅠ双耦合作用，进而引发非模板依赖的基于TdT酶的DNA扩增反应。扩增反应形成的长链DNA能与scGFP集合，使其聚集，保留scGFP的荧光。因此，通过溶液荧光的变化可实现对Dam甲基化酶及其抑制剂的检测。该方法对Dam甲基化酶的检测有较宽的线性范围(0.1U/mL～100U/mL)，且有较低的检测限(0.1U/mL)。本方法操作简单、灵敏度高、无需复杂昂贵的DNA修饰过程。本方法还可以拓展到其他核酸酶及其抑制剂的检测。
　　(2)基于超电荷绿色荧光蛋白(scGFP)荧光和带正电荷的双重性质及G-四链体-hemin复合物的荧光猝灭性质，构建了一种荧光分析方法用于端粒酶活性的检测。端粒酶能以自身RNA为模板合成重复的富G序列(TTAGGG)，进而引发等温链取代反应，生成更多的富G序列。这些富G序列在hemin存在下，形成G-四链体-hemin复合物，通过静电作用与scGFP结合，并猝灭scGFP的荧光。通过溶液荧光强度的变化可实现对端粒酶活性的检测。该方法对端粒酶活性的检测有较宽的线性范围(100-1000cells)，且有较低的检测限(60cells)。
　　(3)基于量子点独特的荧光性质及抗坏血酸的还原性，构建了一种新型的荧光分析方法用于抗坏血酸的检测。抗坏血酸能还原Pb2+，进而破坏PbS的结构，导致BSA-PbS量子点荧光的猝灭。该方法对抗坏血酸有较低的检测限(0.83μM)，并成功运用于实验水果样品抗坏血酸含量的检测，且在添加回收实验中获得了比较满意的回收率(95.2-97.9％)。与以往基于量子点的抗坏血酸的检测方法相比，该方法中的量子点制备简单、不需要复杂的修饰过程，且响应速度快，仅需2分钟就能完成对抗坏血酸的检测。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 绿色荧光蛋白(GFP)概述

1．1．1 绿色荧光蛋白的发现与发展历程

1．1．2 绿色荧光蛋白的结构和发光机理

1．1．3 绿色荧光蛋白的性质和应用

1．1．4 超正电荷绿色荧光蛋白的性质和应用

1．2 石墨烯

1．2．1 石墨烯简介

1．2．2 氧化石墨烯(GO)在光学传感方面的应用

1．3 G-四链体的简介

1．3．1 G-四链体及其结构特点

1．3．2 G-四链体的应用

1．4 量子点(QDs)的简介

1．4．1 量子点的基本特性

1．4．2 量子点的合成及标记方法

1．4．3 量子点在生命科学中的应用

1．5 本文构思

第2章 基于氧化石墨烯与超电荷绿色荧光蛋白相互作用的甲基化酶荧光分析法

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器与试剂

2．2．2 超电荷绿色荧光蛋白的表达与纯化

2．2．3 DNA甲基化酶及抑制剂的检测

2．2．4 琼脂糖凝胶电泳分析

2．2．5 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的检测

2．3 结果与讨论

2．3．1 DNA甲基化酶检测的原理及验证

2．3．2 实验条件优化

2．3．3 Dam MTase活性及抑制剂的检测

2．3．4 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的检测

2．4 本章小结

第3章 基于G-四链体-hemin与超电荷绿色荧光蛋白相互作用的端粒酶荧光检测方法

3．1 前言

3．2．实验部分

3．2．1 实验仪器与试剂

3．2．2 超电荷绿色荧光蛋白的表达与纯化

3．2．3 细胞的培养和端粒酶提取物的制备

3．2．4 端粒酶延伸及等温链取代反应

3．2．5 凝胶电泳实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 基于G-四链体-hemin复合物猝灭scGFP荧光检测端粒酶活性的原理以及论证

3．3．2 端粒酶提取物活性的验证

3．3．3 实验条件优化

3．3．4 细胞提取物中端粒酶活性的检测

3．4 本章小结

第4章 基于近红外量子点的抗坏血酸荧光检测新方法

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂与仪器

4．2．2 量子点的制备

4．2．3 抗坏血酸的检测

4．2．4 干扰实验

4．2．5 水果样品中抗坏血酸的检测

4．2．6 荧光成像实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 基于近红外量子点(BSA-PbS QDs)检测抗坏血酸(Vc)的实验原理及验证

4．3．2 抗坏血酸的检测

4．3．3 干扰实验

4．3．4 水果样品中抗坏血酸的检测

4．3．5 回收率实验

4．4 本章小结

结论

参考文献

附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢