无标记核酸探针的构建及其在高灵敏核酸检测中的应用

摘要

核酸探针作为现代研究生命科学的一种基本检测工具，与一般的检测方法相比，具有高灵敏度、强稳定性、高特异性、易于合成、设计简单等优点。科研工作者在已经研发出的核酸探针基础上，不断开发出一系列新型核酸探针及其检测方法，并广泛应用到生物学、化学、医学诊断以及疾病检测等多个领域。基于此，本论文基于循环链置换扩增技术和核酸外切酶Ⅰ，构建了新型无标记核酸探针，并应用于核酸的高灵敏检测，具体开展了以下三个方面的工作:
　　1、发展了一种基于聚合酶链置换循环扩增的无标记长尾核酸探针体系。在此体系中，核酸探针既可以作为靶分子的识别探针又可以是聚合酶的反应模板，并且结合具有链置换活性的聚合酶，设计简单、操作简便，成本低。并且，该体系中无需直接扩增目标分子，在等温条件下实现循环聚合反应，不容易发生由于外源性污染导致的假阳性反应，可以对核酸进行定量检测分析。
　　2、发展了一种基于新型核酸探针介导信号放大方法用于高灵敏检测核酸。新型长尾核酸探针的长尾在引物退火延伸过程中延能长双链DNA产物，嵌入更多的SG荧光染料分子，释放出强的荧光信号，与循环扩增反应相结合，提高核酸检测的灵敏度，检测下限达到50aM。与分子信标探针检测方法相比，该方法的优势在于不用标记，且长尾探针介导的产物能使检测信号放大，进一步提高核酸检测的灵敏度。
　　3、发展了一种基于核酸外切酶Ⅰ的新型核酸探针用于超灵敏检测DNA或miRNA。核酸外切酶Ⅰ能特异性从3'→5'切割DNA单链，当没有靶分子存在时，其能效地从3'-OH端降解探针和引物，很大程度上降低荧光背景信号，提高了信噪比，使核酸检测灵敏度得到大幅度提高。在有靶分子存在条件下能诱发等温链置换聚合反应后形成大量长的DNA双链产物，产生很强的荧光信号，使新型核酸探针的检测灵敏度达到PCR级的检测水平，检测下限为5zM，比一般分子信标探针的检测下限降低了6个数量级。此外，该方法也能检测相似度很高的不同miRNA分子，其检测下限也达到5zM，说明方法的选择性很好。

目录

声明

摘要

本文所用英文缩写词表

第1章 绪论

1．1 核酸探针的概述

1．1．1 核酸探针的原理

1．1．2 核酸探针的分类

1．2 传统克隆探针

1．2．1 DNA分子探针

1．2．2 cDNA分子探针

1．2．3 RNA分子探针

1．3 新型寡核苷酸探针

1．3．1 TaqMan探针

1．3．2 相邻探针

1．3．3 核酶探针

1．3．4 核酸适体探针

1．3．5 信标探针

1．3．6 无标记核酸探针

1．4 本论文拟开展的工作

第2章 无标记长尾核酸探针体系的构建

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果和讨论

2．3．1 实验设计原理

2．3．2 无标记长尾探针茎部长度的考察

2．3．3 无标记长尾探针尾部长度的考察

2．3．4 无标记长尾探针浓度的考察

2．3．5 传统方法验证无标记长尾探针的聚合反应

2．4 小结

第3章 新型核酸探针用于核酸的高灵敏检测

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器与试剂

3．2．2 实验方法

3．3 实验结果和讨论

3．3．1 实验设计原理

3．3．2 新型核酸探针对核酸检测的影响因素考察

3．3．3 新型核酸探针对靶DNA序列的高灵敏检测

3．3．3 新型核酸探针检测核酸的选择性考察

3．3．4 新型核酸探针在总RNA中检测HCV

3．4 小结

第4章 低背景信号新型核酸探针的构建及其应用

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 仪器与试剂

4．2．2 实验方法

4．3 实验结果和讨论

4．3．1 实验设计原理

4．3．2 新型核酸探针的设计

4．3．3 核酸外切酶Ⅰ对检测信噪比的影响

4．3．4 实时监测核酸外切酶Ⅰ对新型核酸探针的降解

4．3．5 核酸外切酶Ⅰ的浓度和新型核酸探针的茎部长度的考察

4．3．6 考察低背景信号新型核酸探针的检测特异性

4．3．7 对核酸的高灵敏检测

4．3．8 对实际样品HCV-RNA的检测

4．4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢