基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3机制研究

摘要

目的:应用柯萨奇病毒B3(CVB3)腹腔注射建立病毒性感染小鼠模型，予以新扶正除疫颗粒剂干预，检测小鼠一般状况、死亡率、肺组织病毒滴度及病理形态学变化、血清中IFN-γ、IL-4、IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表达、凋亡因子Caspase-9及心肌组织中磷酸化AKT(p-AKT)和NF-kB的表达，探讨新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3的功效及其作用机制。
　　方法:包括体外和体内实验两部分。
　　1.新扶正除疫颗粒体外抗柯萨奇病毒B3作用研究:体外培养心肌细胞后，进行CVB3的培养和制备并进行CVB3病毒滴度的测定，按Reed-Muench方法计算TCID50;在培养板中观察新扶正除疫颗粒剂抗病毒吸附作用、对染毒心肌细胞的保护和抑制CVB3增殖作用实验。
　　2.体内实验
　　2.1柯萨奇病毒B3(CVB3)动物模型的建立、分组及给药:将144只BALB/c小鼠采用随机方法平均分为6组，每组24只，按照表面积换算给药量，按如下方法分组造模及给药:空白组;生理盐水灌胃，剂量是0.4ml/只，每日1次，连续7天;病毒模型组:生理盐水灌胃，剂量是0.4ml/只，每日1次，连续7天;新扶正除疫颗粒剂低剂量组:以新扶正除疫颗粒剂中成药量4.5g/(kg·d)灌胃，以上各组均连续7天，每日1次;新扶正除疫颗粒剂中剂量:以新扶正除疫颗粒剂中成药量9g/(kg·d)灌胃;每日1次，连续7天;新扶正除疫颗粒剂高剂量:以新扶正除疫颗粒剂中成药量18 g/(kg·d)灌胃;每日1次，连续7天;利巴韦林对照组（即阳性药物对照组）:以利巴韦林水溶液0.025g/(kg·d)灌胃，每日1次，连续7天。给药第3天，给每只小鼠腹腔注射50ulCVB3溶液(10×TCID50)，常规饲养，造模后1小时后各组继续给药，存活72小时以上，且体重显著降低，证实病毒感染模型成功建立。
　　2.2新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3感染作用及机制研究:从攻毒后感染之日（即给药第3天）起，随机选择每组中10只小鼠，连续对其观察7天，用于评价新扶正除疫颗粒剂对CVB3感染小鼠的一般状态及死亡保护作用。并且对每组另外剩余的小鼠进行心、肺等脏器病毒滴度和HE染色观察。采用流式细胞仪检测技术，观察新扶正除疫颗粒剂对CVB3染毒小鼠Th1免疫IFN-γ和Th2免疫IL-4表达的影响;采用ABC-ELISA法测定血清中IL-1β、IL-6及TNF-α表达的影响;采用流式细胞仪检测技术观察新扶正除疫颗粒剂对心肌细胞凋亡因子Caspase-9的影响;采用Western blot法观察新扶正除疫颗粒剂对心肌组织中磷酸化AKT(p-AKT)和NF-kB蛋白表达的影响。
　　结果:
　　1.新扶正除疫颗粒剂体外抗CVB3实验结果。新扶正除疫颗粒剂能够对染毒心肌细胞起到很好的保护作用，其中0.8 mg/ml新扶正除疫颗粒剂对心肌细胞保护作用明显，能够阻止CVB3的吸附作用。同时，该药物能够抑制CVB3的增殖的作用，抑制效果与药物浓度正相关。
　　2.新扶正除疫颗粒剂体内抗柯萨奇病毒B3作用研究结果:新扶正除疫颗粒剂细胞毒性低，并且能够有效缓解染毒小鼠组织缺氧、缺血和坏死的症状和体征，能够降低染毒小鼠的死亡率。病毒滴度:感染病毒7天后，检测了不同组心、肺、肾脏组织中病毒滴度，发现中剂量组新扶正除疫颗粒剂组低于病毒模型组（P＜0.05），高剂量新扶正颗粒剂组显著低于病毒模型组和低剂量组（P＜0.01）;心、肺组织病理变化:心肌病理变化方面，中剂量和高剂量给药组炎性细胞浸润明显减轻，其中高剂量组对心肌保护作用更加明显，同利巴韦林药物对照组相似;肺组织病理变化方面，中剂量和高剂量给药组炎症病变明显减轻，其中高剂量新扶正除疫颗粒组的结果更佳，与利巴韦林阳性药物对照组结果相似。
　　3.在观察新扶正除疫颗粒剂抗CVB3感染机制探讨方面结果:对相关免疫学指标进行了检测，新扶正除疫颗粒剂中、高剂量组和利巴韦林组的IFN-γ和IL-4数值均明显升高，与病毒模型组比较，有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）;低剂量组与病毒模型组比较无显著性差异(P＞0.05);对血清中IL-1β、IL-6及TNF-α表达进行了检测，新扶正除疫颗粒剂中、高剂量组和利巴韦林组的IL-1β、IL-6及TNF-α表达均明显下降，与病毒模型组比较，有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）;低剂量组与病毒模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。对心肌细胞凋亡因子Caspase-9蛋白表达进行检测，新扶正除疫颗粒剂中、高剂量组和利巴韦林组的凋亡因子Caspase-9蛋白表达均明显升高，与病毒模型组比较，均有显著性差异(p＜0.01)，其中高剂量组与病毒组比较差异性更加明显(P＜0.001);高剂量组与利巴韦林组比较有极显著差异（P＜0.01）。对心肌细胞p-AKT和NF-κB蛋白表达结果进行检测，与病毒组比较，生理盐水组蛋白表达程度最高，其次是低剂量组、中剂量组;新扶正除疫颗粒剂高剂量组蛋白表达最低，与利巴韦林组结果相近。
　　结论:
　　1新扶正除疫颗粒剂在抗CVB3感染体外实验中表现出良好的效果。对染毒心肌细胞观察发现，新扶正除疫颗粒剂能够明显减轻CVB3染毒细胞病变程度，抑制CVB3的增殖，对染毒心肌细胞起到很好的保护作用，作用效果与药物浓度呈正相关，而且新扶正除疫颗粒剂的细胞毒性较低。
　　2.新扶正除疫颗粒剂在抗CVB3小鼠感染作用实验中效果明显。新扶正除疫颗粒剂能够有效缓解染毒小鼠组织缺氧、缺血和坏死的症状和体征，能够降低染毒小鼠的死亡率，抑制病毒在心、肺和肾脏等脏器中的增殖，能够有效抑制小鼠心、肺组织的过度的炎症表现，对染毒小鼠的脏器有一定的保护作用。
　　3.新扶正除疫颗粒剂能够提高CVB3染毒小鼠的细胞免疫功能，有利于介导细胞免疫反应，提高对细胞内病毒的清除。其作用机制可能是与新扶正除疫颗粒剂能够提高IFN-γ和IL-4表达相关。
　　4.血清细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β与心肌细胞病毒感染严重程度呈正相关;新扶正除疫颗粒剂能够降低柯萨奇病毒B3染毒小鼠的血清细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。
　　5.新扶正除疫颗粒剂能够升高柯萨奇病毒B3染毒小鼠心肌细胞凋亡因子Caspase-9的表达。Caspase-9是细胞凋亡的启动因子，它本身无法直接达到促凋亡作用，而是需要通过对核心凋亡蛋白酶Caspase-3的激活，然后由Caspase-3激发凋亡级联反应诱发细胞凋亡。新扶正除疫颗粒剂促进细胞凋亡的机制可能是通过升高Caspase-9表达而促进染毒细胞的凋亡，从而抑制病毒在机体内的复制与增殖。
　　6.新扶正除疫颗粒剂能够降低心肌组织中磷酸化AKT(p-AKT)和NF-kB的表达。PI3K-AKT-mTOR是哺乳动物细胞内一条重要的免疫信号通路，该通路由上游信号传导因子PI3K、下游信号因子Akt和底物因子mTOR组成。Akt对病毒复制的过程有重要的调节作用，在CVB3感染过程中，经磷酸化激活的Akt具有明确的抗凋亡作用;活化后的Akt，能够促使下游核转录因子NF-κB转入细胞核，使NF-κB发挥其抑制细胞凋亡、促进细胞增殖与存活的功能。新扶正除疫颗粒剂抗CVB3感染的作用机制有可能与其抑制了细胞通路PI3K-AKT-mTOR相关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

文献综述

综述一 柯萨奇病毒B3型研究进展

综述二 中医药防治柯萨奇病毒B3实验研究进展

综述三 PI3K-Akt-mTOR信号通路研究进展

实验研究

实验一 新扶正除疫颗粒体外抗柯萨奇病毒B3作用研究

实验二 新扶正除疫颗粒体内抗柯萨奇病毒B3作用研究

实验三 新扶正除疫颗粒剂对感染CVB3小鼠T细胞亚群的影响

实验四 新扶正除疫颗粒剂对感染CVB3小鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α表达的影响

实验五 新扶正除疫颗粒剂对感染CVB3小鼠Caspase-9表达的影响

实验六 新扶正除疫颗粒剂对感染CVB3小鼠心肌组织中P-AKT和NF-κB表达的影响

讨论

1．柯萨奇病毒B3感染模型的建立

2 新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3作用研究

3 新扶正除疫颗粒剂抗柯萨奇病毒B3型作用机制研究

结语

致谢

参考文献