核酸探针与环糊精聚合物用于生物分子荧光检测的研究

摘要

准确和灵敏地获取生物样品中小分子、核酸的相关信息对生物医学研究以及临床诊断和治疗都具有十分重要的意义。近年来，功能化荧光核酸探针在生物分析领域受到广大研究者的广泛关注，人们利用核酸探针技术发展了一系列新颖的检测方法，来获取生命过程中的各种信息。
　　环糊精聚合物具有包络识别能力、稳定性强、溶解度大及多价结合效应等优点。研究发现β-环糊精聚合物对芘有显著的荧光增强作用，可与其它检测方法相结合，发展更加灵敏的分析检测方法。基于此，本文利用核酸探针技术，并结合工具酶和β-环糊精聚合物，建立了三种检测生物分子的荧光方法，具体内容如下:
　　1.基于β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用，并结合核酸催化动力学组装发展了一种灵敏检测DNA的方法。设计了一条5'末端标芘的发夹探针H1和一条未标记的发夹探针H2，没有目标DNA存在时，两条发夹探针能够稳定存在，末端芘很容易嵌入β-环糊精聚合物的空腔，引起荧光信号显著增强;有目标DNA存在时，可以触发探针H1打开，并与探针H2杂交形成双链H1/H2，此时芘在双链的凹陷端，由于空间位阻较大不易嵌入β-环糊精聚合物空腔，荧光较弱。这一检测方法探针设计简单，实验过程简便，无需复杂的热循环过程，能实现DNA的灵敏检测，其检测限为10 pmol L-1，并且具有较好的选择性。此外，该方法实现了细胞裂解液中目标DNA的检测，有望发展为一种通用的核酸检测方法。
　　2.基于β-环糊精聚合物对芘的荧光增强效果并结合催化发夹组装，建立了一种腺苷的荧光检测方法。设计了一条5'末端标芘的发夹探针H1和一条未标记的发夹探针H2，一条双链探针Aptamer-trigger/Inhibitor。无目标物腺苷存在时，各探针稳定存在，发夹探针末端芘很容易嵌入β-环糊精聚合物空腔，荧光信号显著增强;当有腺苷存在时，腺苷与aptamer序列结合，将Inhibitor链竞争下来，暴露出trigger序列可以与发夹探针H1杂交，打开发夹探针H1，继而打开发夹探针H2形成双链复合物H1/H2，同时释放出trigger进行循环。此时芘在双链的凹陷端，由于空间位阻不易嵌入β-环糊精聚合物，荧光信号较弱。本方法只需在探针上标记单个芘，探针易于设计，无需昂贵的酶试剂，实验操作简便，实现了腺苷的灵敏检测，检测限为42 nmol L-1，并且具有良好的选择性，还实现人血清中腺苷的检测。
　　3.基于β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用，并结合核酸外切酶Ⅲ的信号放大技术，发展了一种灵敏检测DNA的方法。检测体系中包含一条发夹探针（芘标记在茎部的中间位置一个碱基上）、ExoⅢ、环糊精聚合物。当有目标DNA存在下，DNA能与发夹探针杂交并形成双链的构型，ExoⅢ能逐步酶切不断产生标芘的单个核苷酸。单个核苷酸上标记的芘很容易嵌入到环糊精聚合物疏水的空腔，荧光信号得到显著的增强。此时目标DNA可以被释放出来，重新与其他发夹探针杂交，引起荧光信号的不断放大，实现了对目标DNA的灵敏检测。本方法与传统的分子信标相比，不需要标记淬灭基团，设计新颖，灵敏度和选择性均较好，对目标DNA的检测限为17 pmol L-1。

目录

声明

摘要

本文所用英文缩写词表

第1章 绪论

1．1 酶辅助的核酸探针检测技术

1．1．1 聚合酶辅助的核酸探针技术

1．1．2 切刻酶辅助的核酸探针技术

1．2．3 限制性内切酶辅助的核酸探针技术

1．1．4 连接酶辅助的核酸探针技术

1．1．5 核酸外切酶辅助的核酸探针技术

1．2 无酶辅助的核酸探针技术

1．2．1 催化发夹组装技术

1．2．2 杂交链式放大技术

1．2．3 核酶探针技术

1．2．4 基于纳米材料的核酸探针技术

1．2．5 基于双链替换反应的核酸探针技术

1．3 本文拟开展的研究工作

第2章 基于催化发夹组装与β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用用于DNA的检测

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 主要试剂和仪器

2．2．2 合成β-环糊精聚合物

2．2．3 可行性考察

2．2．4 实验条件优化

2．2．5 定量检测

2．2．6 Target DNA选择性考察

2．2．7 电泳实验验证

2．2．8 实际样品中Target DNA的检测

2．2．9 延长序列Prolonged DNA的检测

2．3 结果与讨论

2．3．1 检测原理

2．3．2 可行性的验证

2．3．3 实验条件优化

2．3．4 定量检测

2．3．5 选择性的考察

2．3．6 实际样品中Target DNA的检测

2．3．7 延长序列Prolonged DNA的检测

2．4 小结

第3章 基于催化发夹组装与β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用用于腺苷的检测

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 主要试剂和仪器

3．2．2 可行性考察

3．2．3 实验条件优化

3．2．4 腺苷定量检测

3．2．5 选择性考察

3．2．6 血清中的腺苷检测

3．2．7 电泳实验验证

3．3 结果与讨论

3．3．1 检测原理

3．3．2 可行性考察

3．3．3 实验条件优化

3．3．4 腺苷定量检测

3．3．5 选择性考察

3．3．6 血清中的腺苷检测

3．4 小结

第4章 基于酸外切酶Ⅲ辅助的信号放大与β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用用于DNA的检测

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 主要试剂和仪器

4．2．2 可行性考察

4．2．3 实验条件优化

4．2．4 DNA的定量检测

4．2．5 选择性考察

4．2．6 电泳实验验证

4．3 结果与讨论

4．3．1 检测原理

4．3．2 可行性验证

4．3．3 实验条件优化

4．3．4 DNA定量检测

4．3．5 选择性考察

4．4 小结

结论

参考文献

攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢