间充质干细胞与未成熟树突状细胞联合胰岛细胞移植治疗小鼠糖尿病

摘要

胰岛移植手术操作简单，可减少外源胰岛素使用，降低并发症风险，有望成为糖尿病最终治疗方案。近年来，随着胰岛移植研究的广泛开展，胰岛移植技术也取得了很大进展，但是胰岛数量不足以及术后免疫排斥反应仍然是胰岛移植最终进入临床阶段的最大阻碍。本论文在探究建立高效胰岛分离技术以及胰岛移植治疗糖尿病小鼠的基础上，进一步探究了移植后利用未成熟树突细胞(immature dendritic cells，imDCs)与间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)诱导胰岛移植物免疫耐受的潜在机制和应用价值。
　　本文的主要研究内容归纳如下:
　　1.建立了糖尿病小鼠模型。本研究利用链脲佐菌(STZ)能选择性对胰岛β细胞造成损伤的特点，按照100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg的剂量，一次性腹腔注射小鼠，进行造模。研究结果表明，对于小鼠而言，150mg/kg剂量造模效果最佳，200mg/kg剂量的STZ虽然也能快速导致小鼠血糖升高，但是此剂量可能对于小鼠机体损伤较大，导致部分小鼠死亡，不利于模型的建立。
　　2.建立了分离纯化大鼠胰岛细胞方法。胰岛移植物质量和数量不足是影响胰岛移植效果的重要原因，本研究通过改进胰腺胶原酶灌注消化和密度梯度离心方法纯化胰岛，提高了胰岛的产量和质量，获得了满意的效果。
　　3.成功分离培养了未成熟树突细胞(imDCs)和骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)。将培养的树突细胞经流式细胞仪分析鉴定，结果发现小鼠骨髓来源的树突细胞高表达CD11c(89.9％)，中度表达MHC-Ⅱ(36.61％)，低表达CD80(5.03％)、CD86(1.5％)，符合imDC表面标志物的特征;对培养的间充质干细胞进行体外成骨和成脂诱导分化，结果表明贴壁法培养的间充质干细胞同样具有多项分化潜能.
　　4.将imDCs与MSCs应用于胰岛移植治疗糖尿病小鼠中，结果发现胰岛与未成熟树突细胞混合移植虽未显著延长移植物的存活时间(12±2.31 d)，但能显著降低其血糖水平;胰岛与间充质干细胞可使血糖下降到较低水平，移植物存活时间达12±2.65天;胰岛与间充质干细胞、未成熟树突细胞共同移植可使糖尿病鼠血糖下降并显著延长移植物的存活时间（15.6±3.48 d）。结果说明联合移植在一定程度上可延长移植物的存活时间并使血糖维持在较低的水平，较单独移植胰岛治疗小鼠糖尿病有积极作用。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 糖尿病分类及发病机制

1．2 糖尿病诊断标准

1．3 胰岛移植治疗糖尿病

1．3．1 胰岛移植与胰腺移植

1．3．2 胰岛移植治疗糖尿病研究进展

1．4 树突细胞诱导免疫耐受

1．4．1 树突状细胞

1．4．2 树突细胞与移植免疫耐受

1．4．3 树突细胞的体外培养及鉴定

1．5 间充质干细胞与胰岛移植

1．5．1 间充质干细胞

1．5．2 间充质干细胞与免疫耐受

1．6 树突细胞与间充质干细胞的相互联系

1．7 本文的选题背景和研究意义

1．8 拟展开的工作

第2章 腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠糖尿病模型

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂与材料

2．2．3 试剂配制

2．2．4 实验动物

2．3 实验方法

2．4 结果与讨论

2．3 小结

第3章 大鼠胰岛细胞的分离纯化以及移植模型的建立

3．1 引言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验材料与试剂

3．2．3 实验动物

3．3 实验方法

3．3．1 大鼠胰岛细胞分离与纯化

3．3．2 胰岛细胞经DTZ染色鉴定

3．3．3 胰岛细胞存活率分析

3．3．4 葡萄糖刺激胰岛细胞胰岛素释放浓度的测定

3．3．5 胰岛细胞体内功能评价

3．4 结果与讨论

3．4．1 胰岛的形态及鉴定

3．4．2 离体胰岛的活力检测

3．4．3 葡萄糖刺激分离的胰岛细胞胰岛素释放浓度

3．4．4 胰岛细胞体内功能评价

3．5 小结

第四章 小鼠未成熟树突细胞与大鼠间充质干细胞的分离纯化及功能研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂与材料

4．2．3 实验动物

4．3 实验方法

4．3．1 未成熟树突细胞的分离、培养

4．3．2 未成熟树突细胞的流式鉴定

4．3．4 MSC的鉴定

4．3．4 imDC与BM-MSC体外免疫功能研究

4．4 结果与讨论

4．4．1 树突细胞的形态观察

4．4．2 树突细胞表面标志分子表达情况

4．4．3 MSC形态观察及成脂成骨诱导鉴定

4．4．4 imDC与MSC对MLR中T淋巴细胞抑制作用

4．4 小结

第五章 未成熟树突细胞与间充质干细胞在胰岛移植中的潜在作用的研究

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 实验动物

5．2．2 实验仪器

5．2．3 实验试剂与材料

5．3 实验方法

5．3．1 未成熟树突细胞诱导胰岛移植中免疫耐受的研究

5．3．2 间充质干细胞诱导胰岛移植中免疫耐受的研究

5．3．3 未成熟树突细胞与问充质干细胞诱导胰岛移植中免疫耐受的研究

5．3．4 胰岛移植后评估

5．4 结果与讨论

5．4．1 未成熟树突细胞诱导糖尿病小鼠胰岛移植免疫耐受

5．4．2 骨髓问充质干细胞诱导糖尿病小鼠胰岛移植免疫耐受

5．4．3 未成熟树突细胞与间充质干细胞联合诱导糖尿病小鼠胰岛移植免疫耐受

5．4．4 移植后糖化血红蛋白检测

5．5 小结

结论与展望

参考文献

致谢

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