重复序列和抗性基因在栽培稻与野生稻基因组中的比较分析

摘要

1.利用栽培稻C0t-1 DNA和基因组DNA(gDNA)作为探针，分别对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻进行荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交(CGH)。C0t-1 DNA覆盖栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组比例(％)和大小(Mb)分别为47.1±0.16，38.61±0.13，44.38±0.13和212.33±1.21，269.42±0.89以及532.56±1.68。说明稻属中度和高度重复序列和功能基因一样，在不同种中也存在着高度同源性和保守性，并在进化过程中得以保存下来。药用野生稻和疣粒野生稻基因组增大的重要原因之一，可能是基因组中度和高度重复序列加倍的结果，药用野生稻这种序列扩增相对疣粒野生稻要缓和得多。栽培稻gDNA在药用野生稻和疣粒野生稻基因组中的覆盖率约为91.0％和93.6％，含量分别约为634 Mb和1123 Mb，各有365 Mb和591 Mb不属于源自栽培稻基因组的中高度重复序列，未被栽培稻gDNA所覆盖的部分，分别为64 Mb和78 Mb左右。说明有可能是这2个种在长期进化过程中，由于存在加倍、重排和基因选择性丢失等现象形成具有自己种的特异性的基因组成分。 2.用药用野生稻(CC)C0t-1 DNA作为探针，对其自身体细胞染色体和栽培稻×药用野生稻杂交后代F1、回交后代BC1，以及宽叶野生稻(CCDD)、高秆野生稻(CCDD)和斑点野生稻(BBCC)体细胞染色体进行荧光原位杂交实验。对F1(AC)和两个BC1(AAC和ACC)的杂交实验中，在不封阻的情况下，药用野生稻C基因组C0t-1 DNA探针能清晰地鉴别C组染色体，而在A组染色体上信号分布很少，说明A基因组与药用野生稻C基因组中高度重复序列同源性较低。此外，对宽叶野生稻、高杆野生稻和斑点野生稻3个四倍体体细胞进行了FISH分析，在24条C组染色体上均可观察到较强的杂交信号，B和D基因组的24条染色体上信号较少，但在D组染色体上的信号较B组染色体的多，说明D与C基因组的亲缘关系较B与C基因组的近。进一步分析发现，高杆野生稻D组染色体上的杂交信号要比宽叶野生稻D组染色体上的杂交信号多，说明高杆野生稻的D基因组与C基因组的同源性要高，这可能是高秆野生稻和宽叶野生稻同属于CCDD染色体组型但可区分为不同种的原因之一。上述研究表明C0t-1 DNA具有很强的种的特异性和依赖基因组型的特异性，利用C0t-1 DNA作探针更能有效地对不同基因组进行FISH鉴定。同时，本研究采用F1植株和BC1植株，即一个二倍体和两个三倍体人工选育杂种，与宽叶野生稻、高杆野生稻和斑点野生稻进行了基于C基因组C0t-1 DNA杂交的比较分析，对稻属异源四倍体的可能起源机制进行了初步探讨。 3.生物素标记的药用野生稻总DNA作为探针，未标记的栽培稻总DNA作封阻，对药用野生稻异源单体系(MAALs)减数分裂染色体进行GISH分析。结果表明，在栽培稻(AA，2n=24)基因组中附加了一条药用野生稻染色体，并鉴定为第8号染色体。本研究表明，药用野生稻异源单体附加系的建立为药用野生稻的基因组学和遗传学的研究提供一个新的操作平台，而GISH技术在水稻远缘杂交育种中是最准确有效的染色体鉴定方法，在水稻育种改良中具有重要应用前景。 4.基于C0t-1 DNA杂交带型，对栽培稻、非洲栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻进行核型分析，并构建了相应模式图。并选用了一个同时分布在栽培稻和药用野生稻第8染色体上的RFLP标记R2676(1.8 kb)，首次对非洲栽培稻和药用野生稻的第8染色体进行比较体核型分析。同时，结合栽培稻第8染色体C0t-1 DNA在非洲栽培稻和药用野生稻分布特征，初步阐述了基因组重复序列在稻属中的进化特点。 5.用覆盖抗褐飞虱基因Bph15的两个重叠群(contig)，即BAC克隆20M14(27 kb)和64O9(36 kb)为探针，对非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻荧光原位杂交(FISH)。两个BAC克隆均被定位于非洲栽培稻和药用野生稻第4染色体的短臂上，杂交信号的百分距离分别为37.03±4.11和81.22±3.62，相应的信号检出率为41.18％和38.22％。在宽叶野生稻中，有两对同源染色体同时检出信号，分别定位于染色体的短臂上和着丝粒区，信号距着丝粒平均百分距离分别为87.78±5.23和0，信号检出率为52.58％。由此推知，这两个BAC克隆在非洲栽培稻和药用野生稻的第4染色体分布同线且同区，并且在宽叶野生稻上的DD基因组也存在Bph15基因的同源序列。在未封阻的情况下，非洲栽培稻的BAC杂交在多条染色体有信号，这表明它和栽培稻C0t-1 DNA在一定程度上具有同源性。文中初步显示Bph15在三个稻种染色体中的相对位置，在A、C、D三个基因组中连锁关系一致，它们在供试不同种和基因组中都是同线的，而且其连锁关系具有很强的遗传保守性。 6.利用5S rDNA和45S rDNA分别对籼稻“广陆矮4号”(AA)、非洲栽培稻(AA)、药用野生稻(CC)、斑点野生稻(BBCC)、高杆野生稻(CCDD)、宽叶野生稻(CCDD)以及栽培稻×药用野生稻F1植株(ACC)等7个种(包括3个二倍、3个四倍体以及人工选育杂种)进行原位杂交。确定了5S rDNA和45S rDNA在其染色体上的数目和位置，并初步探讨多倍体rDNA的进化关系。结果还表明，稻属中45S rDNA基因座的多态性要远高于5S rDNA，5S rDNA同步进化力量较强，其重复单位间纯合或接近纯合，而45S rDNA这种力量较弱，重复单位间还存在杂合性。这些多态位点为弄清多倍体植物的起源，揭示这些属内植物间的网状进化关系提供了重要证据。