小单孢菌40027菌株位点特异性重组相关序列的克隆及分析

摘要

小单孢菌是一类能产生多种重要抗生素的稀有放线菌，且产生的抗生素结构类型多种多样，就近年来从小单孢菌中发现的新抗生素数目而言，小单孢菌已经超过链霉菌跃居首位。然而关于小单孢菌遗传学和分子生物学，尤其是基因克隆系统方面的研究较少。从小单孢菌40027菌株中分离得到的具有自主复制、整合和自主接合转移功能的质粒pJTU112、小单孢菌噬菌体和链霉菌噬菌体ΦC31衍生质粒pSET152都能以位点特异性重组的方式整合到小单孢菌染色体上，这三种位点特异性重组类型的发现为小单孢菌位点特异性重组机理的研究提供了基础。本研究以福堤霉素A 产生菌——小单孢菌40027菌株作为对象，对质粒pJTU112和质粒pSET152与小单孢菌40027菌株发生位点特异性重组的相关位点进行研究。
　　 小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU112大小为14.1kb，是低拷贝质粒，它能以自主复制状态存在，也能以整合状态存在于染色体上。质粒pJTU112与小单孢菌40027菌株发生位点特异性重组的attP位点位于质粒pJTU112中0.4kbPstⅠ片段上。PstⅠ酶切质粒pJTU112的衍生质粒pJTU113 DNA，用质粒pUC19克隆了包含attP位点的0.4kb片段，得到质粒pSCU200，并对该片段进行序列测定与分析。
　　 高GC含量DNA序列极易形成二级结构干扰PCR扩增，因此PCR扩增GC含量较高的小单孢菌40027菌株DNA时，效果往往不佳。尝试在小单孢菌40027菌株基因组DNA PCR反应体系中，加入不同终浓度的二甲基亚砜，以提高扩增效率，发现在PCR反应体系中二甲基亚砜终浓度为2.5％或4％时，能提高小单孢菌40027菌株基因组DNA扩增的效率。
　　 通过接合转移的方法，质粒pSET152能以链霉菌噬菌体ΦC31的attP位点整合到小单孢菌40027菌株染色体上。为了提高接合转移的频率，本研究对接合转移条件进行了优化。用400μL小单孢菌40027菌株新鲜菌丝体和40μL含有质粒pSET152的大肠杆菌ET12567/pUZ8002菌液共同培养获得的接合转移子频率较高。
　　 采用不同的克隆策略分别克隆了链霉菌噬菌体衍生质粒pSET152与小单孢菌40027 菌株发生位点特异性重组的attB左侧和右侧序列。用限制性内切酶BamHⅠ酶切整合有质粒pSET152的小单孢菌40027菌株总DNA，回收含有阿泊拉霉素抗性基因acc(3)Ⅳ和复制起始区ori(pUC18)的6.3kb片段，自连并转化大肠杆菌，得到克隆质粒pSCU202。酶切和序列分析表明：质粒pSCU200包含质粒pSET152与小单孢菌40027菌株发生位点特异性重组的attB右侧序列。根据质粒pSET152的序列设计了3个特异性巢式引物PF1、PF2 和PF3，以整合质粒pSET152的小单孢菌40027菌株总DNA为模板，通过TAIL-PCR方法扩增质粒pSET152与小单孢菌40027菌株发生位点特异性重组的attB左侧序列，扩增产物大小符合TAIL-PCR扩增规律，第三轮扩增产物为250bp，回收该250bp片段并克隆，构建质粒pSCU203。序列分析表明：质粒pSCU203包含质粒pSET152与小单孢菌40027菌株发生位点特异性重组的attB左侧序列。