小单孢菌40027菌株质粒、噬菌体及其基因克隆系统

摘要

小单孢菌是一类产生许多重要抗生素的稀有放线菌,链霉菌中已发展的成熟的克隆系统不能有效地应用到小单孢菌.该研究以福堤霉素A产生菌——小单孢菌40027菌株作为研究对象,发展该菌株的载体系统和外源DNA导入方法.为了发展小单孢菌40027菌株的克隆系统,首先要确定可用于在该菌株中进行选择的抗生素,为此,检测了小单孢菌40027菌株对不同抗生素的敏感性,初步确定阿泊拉霉素、硫链丝菌素和链霉素的抗性基因有可能用于在小单孢菌40027菌株中进行遗传操作的选择标记.通过一系列实验,初步确定pJTU112的复制子位于11.5kb的PvuII的片段中.利用小单孢菌40027菌株的内源质粒pJTU112,构建了具有接合转移功能的穿梭载体pJTU111和pJTU116,利用pJTU111将完整的来自变铅青链霉菌的dnd基因簇导入小单孢菌40027菌株,并赋予小单孢菌40027菌株Dnd表型.以小单孢菌40027菌株为宿主,分离得到噬菌体ΦHAU8的溶源菌XH8,通过PFGE和Southern杂交实验表明:噬菌体ΦHAU8DNA已整合到小单孢菌40027菌株染色体的500kb的AseI片段中.以pHZ1358为载体,构建了ΦHAU8的基因组文库,从ΦHAU8的基因组文库中得到一个在大肠杆菌中以质粒形式存在,在小单孢菌40027菌株中以噬菌体形式存在的噬粒pJTU120.并制作了噬菌体ΦHAU8和噬粒pJTU120的限制性酶切图谱.

目录

摘 要

Abstract

缩略语

第一章文献综述

1.1小单孢菌研究概况

1.1.1小单孢菌简介

1.1.2小单孢菌诱变育种

1.1.3小单孢菌原生质体融合

1.1.4小单孢菌基因克隆系统

1.2 DNA克隆系统

1.2.1载体系统

1.2.2宿主系统

1.2.3重组DNA分子的转化

1.3链霉菌的基因克隆系统

1.3.1链霉菌的载体系统

1.3.2链霉菌的宿主转化系统

1.4小单孢菌40027菌株简介

1.5本研究的目的

第二章材料与方法

2.1本研究所用到的菌株

2.2本研究所用到的噬菌体与质粒

2.3培养基与化学试剂

2.4实验方法

第三章小单孢菌40027菌株菌丝体培养及其原生质体制备

3.1小单孢菌40027菌株菌丝体的培养

3.2小单孢菌40027菌株原生质体的制备

3.3小单孢菌40027菌株对不同抗生素敏感性

3.4小结

3.5讨论

第四章小单孢菌40027菌株的克隆系统

4.1小单孢菌40027菌株原生质体的转化

4.1.1小单孢菌40027菌株原生质体的转化(转染)

4.1.2小单孢菌40027质粒消除菌株原生质体的转化

4.1.3小单孢菌40027菌株原生质体的热激处理

4.1.4小单孢菌40027菌株转化的其他影响因素

4.1.5小单孢菌40027菌株的NTG诱变

4.2小单孢菌40027菌株的菌丝体电转化系统

4.3小单孢菌40027菌株—链霉菌属间接合转移系统

4.3.1抗生素敏感性的检测

4.3.2小单孢菌40027菌株—链霉菌属间接合转移

4.4小单孢菌40027菌株—大肠杆菌属间接合转移系统

4.4.1大肠杆菌—小单孢菌40027菌株属间孢子接合转移

4.4.2小单孢菌40027菌株—大肠杆菌属间菌丝体接合转移

4.5小结

4.6讨论

第五章小单孢菌40027菌株的质粒

5.1小单孢菌40027菌株内源质粒的发现

5.2小单孢菌40027菌株内源质粒PJTU101

5.2.1小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU101的基本特性

5.2.2小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU101的标记

5.2.3小单孢菌40027质粒消除菌株的筛选

5.2.4质粒消除菌株、标记菌株、恢复菌株与野生型菌株的比较

5.3小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU112

5.3.1小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU112的基本特性

5.3.2 pJTU112衍生质粒的构建

5.3.3小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU112的标记

5.3.4标记质粒pJTU111的稳定性

5.3.5小单孢菌40027质粒消除菌株的验证

5.3.6 pJTU112的自主复制和整合功能

5.3.7 pJTU112整合位点(attP)的定位

5.3.8小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU112复制区的初步定位

5.3.9 pJTU112的自主转移接合功能

5.3.10小单孢菌40027菌株质粒载体的应用

5.4小结

5.5讨论

第六章小单孢菌40027菌株的噬菌体

6.1小单孢菌40027菌株的噬菌体的溶源菌

6.1.1小单孢菌40027菌株噬菌体溶源菌的筛选

6.1.2噬菌体ФHAU8溶源菌的验证

6.2小单孢菌40027菌株的噬菌体成斑必需区的克隆

6.2.1噬菌体ФHAU8基因组文库的构建

6.2.2小单孢菌40027菌株的噬菌体成斑必需区的克隆

6.3小结

6.4讨论

第七章总结与展望

7.1总结

7.2展望

参考文献

致 谢

附录