人面果口山酮抗糖尿病作用及机制研究

摘要

为了进一步开发利用此少数民族传统药用植物，本文对人面果口山酮的抗Ⅱ型糖尿病（Type2 Diabetes mellitus，T2DM）活性进行了初步研究，并对其促进葡萄糖消耗及改善胰岛素抵抗的机制进行了初步探讨。
　　本文首先研究了人面果中分离得到的5个新的口山酮化合物对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗的影响。采用高剂量的牛胰岛素刺激HepG2细胞的方法诱导建立胰岛素抵抗模型（HepG2/IR）。利用MTT法检测口山酮化合物1~5对模型细胞活力的影响。人面果口山酮处理组分为50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1及400μmol·L-1四个浓度梯度（化合物3、4最高浓度设为200μmol·L-1,最低浓度设为25μmol·L-1）。实验结果显示：各化合物25μmol·L-1浓度处理细胞时，细胞的存活率在85％以上。因此设定6.25~25μmol·L-1作为以下实验的参考浓度范围。
　　用葡萄糖氧化酶法研究各化合物对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗的影响。结果显示，5个人面果口山酮化合物的3个（化合物1、3、4）各浓度组均具有促进细胞葡萄糖消耗的作用，各化合物的作用效果随着浓度的增加而增强，即呈现出明显的量效关系。化合物2、5促进 HepG2/IR细胞的葡萄糖消耗的作用稍弱。其中化合物1高浓度组（25μmol·L-1）和中浓度组（12.5μmol·L-1）效果较好，其葡萄糖的消耗量为8.15±0.04 mmol·L-1和7.56±0.20 mmol·L-1，显著高于阳性对照组二甲双胍（**P<0.01）。化合物3各浓度组中均表现出很好的促进葡萄糖消耗的效果，显著高于阳性对照二甲双胍组（***P<0.001）。化合物4各浓度组均不同程度上表现出提高细胞糖消耗的活性。以上结果表明，人面果口山酮化合物具有促进HepG2/IR糖代谢作用。
　　为探讨人面果口山酮化合物促进糖代谢的机制，本文以另一种从人面果中提取的口山酮12b-羟基-去-D-杰氏山竹子素A（12b-hydroxy-des-D-garcigerin A，DGA）为材料，研究了其促进细胞葡萄糖代谢的相关细胞信号途径。在HepG2/IR细胞中添加不同浓度的 DGA处理24 h，测定各组细胞的葡萄糖消耗量、己糖激酶（Hexokinase，HK）和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）活性、胰岛素受体（Insulin receptor，InsR）、胰岛素受体底物-1（Insulin receptor substrates-1，IRS-1）及磷脂酰肌醇3-激酶（Phsphatidyl inositol3-kinase，PI3-K）基因mRNA的表达、以及InsR蛋白及胰岛素受体底物-1/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（IRS-1/PI3-K/AKT）信号通路及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK Thr172）等相关蛋白的表达。研究表明，DGA能够明显促进HepG2/IR细胞的葡萄糖消耗。DGA亦能增加糖代谢关键酶即HK和PK的活力。高浓度（25μmol·L-1）DGA能明显提高HepG2/IR细胞中InsR mRNA的表达，并呈剂量依赖关系；中、高浓度组（12.5μmol·L-1及25μmol·L-1）的DGA也能上调IRS-1 mRNA的表达；中、高浓度组（12.5μmol·L-1及25μmol·L-1）的DGA亦能明显提高PI3-K mRNA基因的表达。此外，DGA促进InsR蛋白表达水平，激活IRS-1/PI3-K/AKT信号通路，提高IRS-1、p-PI3-K、p-AKT ser473蛋白的表达水平，促进葡萄糖的转运，改善细胞的胰岛素抵抗。DGA对细胞内AMPK表达量及AMPK的磷酸化（p-AMPK Thr172）没有影响。研究结果提示，DGA改善胰岛素抵抗不是通过AMPK通路而是通过IRS-1/PI3-K/AKT信号通路。

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第1章 前 言

1.1 糖尿病概述

1.2 胰岛素信号转导途径

1.3 信号转导异常与II型糖尿病

1.3.1 葡萄糖激酶(GK)与II型糖尿病

1.3.2 胰岛素受体(InsR)与II型糖尿病

1.3.3 胰岛素受体底物(IRS)与II型糖尿病

1.3.4 磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)与II型糖尿病

1.3.5 蛋白激酶B(AKT)与II型糖尿病

1.4本研究的意义

第2章 人面果口山酮对胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖代谢的影响研究

2.1仪器与试剂

2.1.1主要仪器

2.1.2试剂

2.1.3化合物

2.2实验方法

2.2.1 HepG2细胞的培养

2.2.2 HepG2胰岛素抵抗细胞模型(HepG2/IR)的建立

2.2.3 人面果口山酮对HepG2细胞存活率的影响

2.2.4 人面果口山酮对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗的影响

2.2.5 统计学分析

2.3实验结果

2.3.1人面果口山酮对HepG2细胞存活率的影响

2.3.2人面果口山酮对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗的促进作用

2.4讨论

第3章 12b-羟基-去-D-杰氏山竹子素A改善HepG2/IR细胞胰岛素抵抗的机制研究

3.1 仪器与试剂

3.1.1主要仪器

3.1.2 试剂

3.1.3 化合物

3.2 实验方法

3.2.1 HepG2细胞的培养

3.2.2 DGA对HepG2细胞存活率的影响

3.2.3 DGA对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗的促进作用

3.2.4 DGA对HepG2/IR细胞己糖激酶及丙酮酸激酶的影响

3.2.5 DGA对HepG2/IR细胞胰岛素信号通路相关基因表达的影响

3.2.6 DGA对HepG2/IR细胞胰岛素信号通路相关蛋白表达的影响

3.2.7 统计学分析

3.3实验结果

3.3.1 DGA对HepG2细胞存活率的影响

3.3.2 DGA对HepG2/IR细胞葡萄糖消耗的影响

3.3.3 DGA对HepG2/IR细胞己糖激酶（HK）及丙酮酸激酶（PK）

3.3.4 DGA对HepG2/IR细胞InsR、IRS-1及PI3-K mRNA表达的影

3.3.5 Western blotting检测DGA对HepG2/IR细胞蛋白表达的影响

3.4讨论

结论

参考文献

致谢

附录A：攻读学位期间发表的学术论文

附录B：相关溶液的配制

附录C：中英文对照缩略词表