野木瓜皂苷抗糖尿病活性及其作用机制

摘要

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）已成为危害全人类生命健康的慢性代谢紊乱疾病，但由于临床上常用化学药物都伴有不同程度的不良反应，而天然药物具有综合治疗作用、安全和几乎无毒副作用等多种优势，因此国内外学者都希望从天然产物中探寻出安全、有效的降糖成分。我们国家DM发病主要为2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus，T2DM），达到总发病率的90％以上，因此，寻找安全高效的治疗T2DM的天然药物更加刻不容缓。在众多具有抗DM活性的天然产物中齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的降糖活性受到了极大关注。
　　野木瓜（Stauntonia chinensis DC.）是含有大量齐墩果烷型三萜皂苷的木通科野木瓜属植物，其生物活性众多，具有镇痛消炎，放射增敏，抗肿瘤，抗补体和促进神经细胞生长等作用，而很少有野木瓜皂苷抗DM病活性及其机制的相关文献报道。为了发现一种安全有效的抗T2DM药物，更好地利用野木瓜资源。本文从野木瓜藤茎中提取分离纯化得到野木瓜总皂苷（简称为总皂苷），并将其中的活性成分利用LC-MS进行了初步分析，推测了其中14皂苷成分的可能结构。
　　本实验以人源肝癌细胞HepG2为实验对象，以高浓度的牛胰岛素诱导其产生胰岛素抵抗（Insulin-resistant，IR），将总皂苷作用于IR的HepG2细胞(HepG2/IR)研究其体外抗糖尿病活性及其作用机制。
　　实验结果显示：总皂苷能显著提高HepG2/IR细胞对外周葡萄糖的摄取及利用能力，降低外周培养基中葡萄糖浓度，高浓度组（25μg/mL组）的葡萄糖消耗量恢复并接近正常细胞水平；总皂苷能剂量依赖性的改善HepG2/IR细胞对脂质的代谢，降低细胞内油脂类物质水平，其高浓度组（25μg/mL组）的效果与二甲双胍组相当。采用Western blot检测HepG2/IR细胞糖代谢相关蛋白时发现，总皂苷能激活IRS-1/PI3K/AKT这一通路，同时增加HepG2/IR细胞内p-AMPK Thr172蛋白表达水平，刺激细胞对外周培养基中葡萄糖的摄取及利用，改善胰岛素抵抗状态。
　　此外，总皂苷体内抗T2DM活性及其作用机制实验在8 weeks龄大小的IR的T2DM型C57 db/db雄性小鼠上进行，以瘦型C57小鼠为正常对照组，以二甲双胍为阳性对照组，总皂苷分别以高（120 mg/kg）、中（60 mg/kg）、低（30 mg/kg）三个剂量连续灌胃给药三周，研究总皂苷体内抗糖尿病活性及其机制。
　　实验结果表明：总皂苷在体内降低T2DM型C57 db/db小鼠的FBG，增加胰岛素敏感性，改善口服糖耐量，提高肝脏、骨骼肌组织中糖原含量。另外，与瘦型C57小鼠相比，模型组小鼠出现的严重脂质代谢紊乱症状，总皂苷能调节模型组小鼠的脂质代谢，使血清中尿素、总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白含量升高，并使血清中低密度脂蛋白含量降低。采用Western blot方法研究总皂苷体内降糖机制时发现，其剂量依赖性的激活肝脏组织IRS-1/PI3K/AKT通路，增加肝脏组织p-AMPK蛋白表达，促进ACC蛋白磷酸化失活，同时提高小鼠骨骼肌中GLUT-4蛋白表达。提示总皂苷抗T2DM，改善IR，可能与上述途径有关。
　　由于总皂苷能显著抗T2DM效果，本实验将从野木瓜中提取分离得到的6个单体皂苷作用于HepG2/IR细胞，观察其抗DM活性及其机制。
　　实验结果显示：6个单体皂苷化合物不同程度地提高了HepG2/IR细胞对葡萄糖的利用能力，降低外周葡萄糖浓度，其中化合物6对HepG2/IR细胞促糖消耗作用最显著，并通过恢复HepG2/IR细胞内HK、PK酶活性至正常水平来调节细胞糖代谢，此外还同时增加细胞内AMPK磷酸化和激活InsR/IRS-1/PI3K/AKT通路，改善IR，起到体外抗DM活性。

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第1章 绪论

1.1 前言

1.2 治疗DM的药用植物

1.3 治疗T2DM的靶点与信号通路

1.4 课题提出

第2章 总皂苷的提取分离与纯化

2.1 前言

2.2 仪器与试剂

2.3 实验方法与结果

2.4 小结

第3章 总皂苷活性成分鉴定

3.1 引言

3.2 色谱条件

3.3 总皂苷的指纹图谱分析

3.4 小结

第4章 总皂苷改善HepG2/IR细胞胰岛素抵抗作用及其机制

4.1 前言

4.2 仪器与试剂

4.3 实验方法

4.4 实验结果与讨论

4.5 小结

第5章 总皂苷改善T2DM型C57 db/db小鼠胰岛素抵抗及其作用机制

5.1 前言

5.2 仪器与试剂

5.3 实验动物

5.4 实验方法

5.5 实验结果

5.6 小结

第6章 单体皂苷通过激活InsR/IRS-1/PI3K/AKT信号通路及p-AMPK活性改善HepG2/IR细胞胰岛素抵抗

6.1 前言

6.2 仪器与试剂

6.3 实验方法

6.4 实验结果与讨论

6.5 小结

结论

参考文献

致谢

附录：攻读学位期间发表的学术论文