藻胆蛋白降解的蛋白质工程研究

摘要

藻胆蛋白是蓝藻进行光合作用必不可少的捕光复合体。本文采用分子生物学和蛋白质工程方法研究蓝藻藻胆蛋白的降解机制，将为从源头控制蓝藻生长、解决水华问题提供重要的帮助。本研究主要内容及结果如下：
　　 ⑴利用多质粒组合在大肠杆菌体内进行重组，得到了具有光学活性的色素蛋白PCB-CpcB(84位)和PCB-CpcB(155位)。对体内重组色素蛋白进行光谱分析，吸收光谱和荧光光谱均表明藻蓝胆素与脱辅基蛋白CpcB形成了共价连接，从而证实在大肠杆菌体内成功生成了色素蛋白PCB-CpcB(84位)和PCB-CpcB(155位)。藻胆蛋白体内重组的实验研究有助于进一步了解藻胆体的构成并对藻胆蛋白在实践中的应用具有重要意义。
　　 ⑵将质粒p ET-oA、pET-oB、pET-rA、pET-cA和pET-cpcA转化大肠杆菌获得表达菌种，进行大量表达，分别获得四种蛋白酶OA、OB、RA、CA与脱辅基蛋白CpcA。同时利用大肠杆菌大量表达并纯化了五种体内重组色素蛋白PCB-ApcA、PCB-ApcB、PCB-CpcA、PCB-CpcB(84位)和PCB-CpcB(155位)。
　　 ⑶研究了OA、OB、RA、CA四种蛋白酶与藻胆蛋白降解之间的关系。首先在体外进行了这四种蛋白酶与脱辅基蛋白CpcA之间的复合物实验。实验结果表明四种蛋白酶与脱辅基蛋白之间均未形成复合物。其次进行了四种蛋白酶分别对五种色素蛋白PCB-ApcA、PCB-ApcB、PCB-CpcA、PCB-CpcB(84位)和PCB-CpcB(155位)的酶活性研究，并对不同温度下蛋白酶的活性大小进行分析比较。实验结果表明四种蛋白酶对于不同的色素蛋白活性显著不同，其中蛋白酶OA的酶活性最大，RA的活性次之，CA的活性最小，而OB对五种色素蛋白均没有活性。同时随着温度的升高，OA、RA和CA蛋白酶的活性显著升高。
　　 ⑷酶活性实验证实了OA、RA和CA蛋白酶对于不同的色素蛋白均显示出酶活性，但活性又显著不同，说明藻胆体的降解机制十分复杂，藻胆蛋白的降解过程很可能存在多种酶的协同作用。三种蛋白酶可能都参与了藻胆蛋白的降解过程，但在降解过程的作用有所不同。OA蛋白酶酶活性最好，推测其参与藻胆蛋白的降解过程并可能发挥重要作用。但在复合物实验中并未发现OA等蛋白酶直接与CpcA形成复合物，说明蛋白酶与CpcA之间的相互作用虽然存在，但形成复合物的过程可能还需要其他辅助因子的参与.这需要在后继的研究中进一步探明。本文的研究结果将对藻胆蛋白降解机制的研究提供有用数据并为从分子生物学层次上解决蓝藻水华问题奠定重要的理论基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 引言

1.1 蓝藻藻胆体

1.1.1 藻胆体概述

1.1.2 藻胆体降解研究

1.1.3 藻胆蛋白

1.1.4 藻胆色素

1.2 藻胆蛋白的体内重组研究现状

1.3 集胞藻PCC6803蛋白酶研究现状

1.3.1 集胞藻PCC6803

1.3.2 蛋白水解酶简介

1.3.3 Clp蛋白酶的研究现状

1.3.4 Deg蛋白酶的研究现状

1.3.5 FtsH蛋白酶的研究现状

1.3.6 Ctp蛋白酶的研究现状

1.3.7 SppA蛋白酶的研究现状

1.4 本课题的研究内容和意义

1.4.1 研究内容

1.4.2 研究意义

第2章 藻蓝蛋白PCB-CpcB的体内重组

2.1 引言

2.2 实验材料、试剂与仪器

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验试剂

2.2.3 实验仪器

2.3 实验原理与方法

2.3.1 感受态细胞的制备

2.3.2 质粒的转化

2.3.3 重组蛋白的表达

2.3.4 细胞的超声破碎

2.3.5 蛋白纯化和透析

2.4 实验结果与分析

2.4.1 PCB-CpcB(84位)的体内重组

2.4.2 PCB-CpcB(155位)的体内重组

2.5 本章小结

第3章 蛋白酶与脱辅基蛋白CpcA的复合物实验

3.1 引言

3.2 实验材料、试剂与仪器

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验试剂

3.2.3 实验仪器

3.3 实验原理与方法

3.3.1 蛋白酶的准备

3.3.2 脱辅基蛋白CpcA的准备

3.3.3 复合物样品的制备

3.3.4 复合物样品的反应

3.3.5 复合物样品的纯化

3.3.6 复合物的SDS-PAGE电泳检测

3.4 实验结果与分析

3.4.1 蛋白酶的表达与纯化效果分析

3.4.2 复合物实验结果分析

3.5 本章小结

第4章 蛋白水解酶对重组色素蛋白的活性实验

4.1 引言

4.2 实验材料、试剂与仪器

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验试剂

4.2.3 实验仪器

4.3 实验原理与方法

4.3.1 色素蛋白的准备

4.3.2 蛋白酶的准备

4.3.2 活性实验方法

4.4 实验结果与分析

4.4.1 色素蛋白表达与纯化效果分析

4.4.2 30℃的活性实验结果与分析

4.4.3 37℃的活性实验结果与分析

4.4.4 不同温度下四种蛋白酶活性比较

4.5 本章小结

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间获得与学位论文相关的科研成果目录