S-烯丙基半胱氨酸对大鼠非酒精性脂肪肝的影响以及机制研究

摘要

目的:
　　研究大蒜中的主要成分S-烯丙基半胱氨酸(S-allylcysteine, SAC)对非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)大鼠的肝保护作用，并对其可能的作用机制进行探讨。
　　方法:
　　1.动物实验分组及造模：正常组(Normal)、非酒精性脂肪肝模型组(Model)、SAC低、中、高剂量组及阿伐他汀钙组(Atorvastatin calcium, ATC)。其中正常组喂养普通饲料，其余各组喂养高脂饲料。SAC低、中、高组分别每天灌胃(Intragastrical, ig)同体积不同浓度的SAC，其剂量分别为25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg。高脂饲料持续喂养12周，每天称取各组大鼠观察其体重变化以及大鼠活动情况。于第4，6，8周模型组剪尾取血检测血清中甘油三酯(Total triglyceride, TG)、胆固醇(Total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白(Low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)，并按血脂水平、体重以及肝组织切片病理学标准筛选符合条件的脂肪肝大鼠。
　　2.SAC体外抗氧化作用：采用DPPH、ABTS、还原力、β-胡萝卜素漂白法(β-beaching)、硫氰酸铁法(Ferric thioeyanate, FTC)和硫代巴比妥酸法(Thiobarbituric acid, TBA)方法检测SAC的体外抗氧化作用。
　　3.SAC对非酒精性脂肪肝大鼠的血脂水平影响以及体内抗氧化作用：连续ig12周后，各组大鼠心脏取血并分离血清，同时将每组大鼠肝组织匀浆，检测血清和肝脏中TG、TC、HDL-C、LDL-C、游离脂肪酸(Nonesterified Free fatty acid, NEFA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)水平、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量和谷胱甘肽过氧化酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)的活性。
　　4.SAC对非酒精性脂肪肝大鼠的肝损伤的影响：检测血清和肝组织内谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)水平以及肝脏组织切片 HE(Hematoxylin and eosin stain)染色。同时用Western blot法检测肝组织中凋亡相关因子Bcl-2和Cleaved Caspase-3表达。
　　结果:
　　1.给药连续12周后，与正常组相比，喂养高脂饲料的模型组体重明显重于正常组，有显著性差异（p<0.05）；与模型组相比，SAC低、中、高剂量组和ATC组均有不同程度的体重减轻，且SAC高剂量组和ATC组均有显著性差异（p<0.05）。在肝重方面，模型组肝重明显重于正常组及SAC高剂量组和ATC组。与正常组相比，模型组肝指数有显著差异（p<0.01）；与模型组相比，SAC高剂量组和ATC组肝指数均有显著性差异（p<0.01）；HE染色结果显示：正常组肝细胞在12周末未出现任何脂肪侵润，而模型组肝细胞出现大量的脂肪空泡, SAC低、中、高剂量组脂肪空泡相对减少，且脂质沉积的程度有一定的缓解。与模型组相比，血清和肝组织中 ALT、AST水平均下降且有显著性差异（p<0.05）；与正常组相比，TG、TC、LDL-C显著升高，HDL-C明显降低且有明显差异（p<0.05）。与模型组相比，TG、TC、LDL-C随着SAC浓度升高而降低，而HDL-C则降低，均有显著性差异（p<0.05）。
　　2.抗氧化实验结果显示：SAC有一定的抗氧化作用；而β-beaching、FTC和TBA法的结果显示SAC在脂质抗氧化作用方面的能力较强；体内抗氧化实验结果显示：模型组中血清和肝脏的SOD和GSH-PX的活性均低于正常组，MDA的水平和GSH的含量均高于正常组（p<0.05）。SAC低、中、高剂量组中随着药物浓度的递增，SOD和GSH-PX的活性也随着增加，而MDA的水平和GSH的含量处于一个逐渐递减的趋势且呈剂量依赖性；Western blot法检测结果显示：SAC低、中、高剂量组中Bcl-2表达明显升高，而Cleaved caspase-3的表达则明显降低。
　　结论:
　　SAC具有较强的体内、外抗氧化能力，特别是抗脂质过氧化能力较强。同时SAC可明显降低NAFLD大鼠体内TG、TC、ALT、AST、HDL-C和NEFA水平，增加 LDL-C水平；提高SOD和GSH-PX的活性,降低MDA的水平和GSH的含量；另外SAC可上调Bcl-2的表达以及下调Cleaved Caspase-3的表达。以上实验结果表明SAC具有明显降低非酒精性脂肪肝大鼠体内血脂水平,并通过抑制脂质过氧化的反应及线粒体的凋亡来保护肝细胞。

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前言

第一部分SAC对NAFLD大鼠血脂的影响及肝保护作用

1.1材料与仪器

1.1.1血脂水平检测相关试剂

1.1.2 仪器

1.1.3 药品

1.2方法

1.2.1实验动物模型分组及模型制备

1.2.2 动物体重及肝指数检测

1.2.3 血清及肝脏中血脂水平的检测

1.2.4 甘油三酯(TG)的检测

1.2.5胆固醇(TC)的检测

1.2.6高密度脂蛋白(HDL-C)的检测

1.2.7低密度脂蛋白(LDL-C)的检测

1.2.8游离脂肪酸(NEFA)的测定

1.2.9组织蛋白浓度的测定

1.2.10谷丙转氨酶(ALT)的检测

1.2.11谷草转氨酶(AST)的检测

1.2.12 石蜡包埋切片

1.2.13 HE染色

1.2.14统计学分析

1.3 结果

1.3.1大鼠体重以及肝指数

1.3.2大鼠血清和肝脏TG、TC、HDL-C、LDL-C和FFA水平

1.3.3AST和ALT水平

1.3.4 HE染色

1.4讨论

第二部分SAC抗大鼠非酒精性脂肪肝机制的研究

2.1材料与仪器

2.1.1材料

2.1.2仪器

2.1.3主要试剂配置

2.2方法

2.2.1总还原力的检测

2.2.2β-胡萝卜素漂白实验

2.2.3硫氰酸铁法

2.2.4硫代巴比妥酸法

2.2.5 DPPH自由基清除实验

2.2.6 ABTS自由基清除实验

2.2.7 超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定

2.2.8 丙二醛（MDA）含量的测定

2.2.9 谷胱甘肽(GSH)含量的测定

2.2.10 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的测定

2.2.11 Western blot法检测肝组织Bcl-2和Cleaved Caspase-3表达

2.2.12 统计学分析

2.3 结果

2.3.1总还原力的检测

2.3.2β-胡萝卜素漂白

2.3.3 FTC法和TBA法

2.3.4 DPPH和ABTS清除自由基活性

2.3.5大鼠血清和肝脏SOD及GSH-PX活性、MDA和GSH水平

2.3.6 Western blot法检测肝组织中Bcl-2和Cleaved Caspase-3表达

2.4.讨论

结论

参考文献

致谢

综述:SAC诱导的保护作用的抗氧化机制

附录1攻读硕士学位期间发表的论文

附录2攻读硕士学位期间参加的科研项目