利用改良胚胎干细胞试验测定双酚A和金属镉的胚胎发育毒性

摘要

目的:建立以神经分化为观察终点的改良胚胎干细胞试验体系，并利用该体系判定双酚A和氯化镉的胚胎发育毒性。
　　方法:①神经分化方法的建立与验证:应用荧光定量PCR检测神经分化过程中神经细胞特异性标志物MAP2、Nestin、KCC2的mRNA表达情况，以探讨最佳胚胎干细胞首次接种密度以及神经细胞培养液培养时间;应用免疫荧光技术检测神经分化过程中神经细胞特异性标志物MAP2、Nestin、KCC2、β-TubullinⅢ的蛋白表达情况，以验证神经分化方法的可行性。②改良EST试验的建立:将建立的神经分化方法与经典EST结合，判定双酚A和氯化镉的胚胎发育毒性。设立阳性对照5-Fu和阴性对照Penicillin-G，以检测该判定体系的可信性。
　　结果:①胚胎干细胞首次接种密度为15×104/孔，神经细胞培养液培养时间为12天，相比于MAP2和KCC2，Nestin更适合作为神经分化抑制试验的检测指标。免疫荧光技术结果表明，神经细胞特异性标志物几乎表达于所有细胞中，表明该神经分化方法可行。②以神经分化为观察终点的EST判定BPA具有弱胚胎发育毒性，而CdCl2具有强胚胎发育毒性。阳性对照5-Fu被判定为具有强胚胎发育毒性，而阴性对照Penicillin-G被判定为无胚胎发育毒性，表明该检测体系具有可信性。
　　结论:本研究初步探讨了胚胎干细胞神经分化方法，在此基础上建立了以神经分化为观察终点的胚胎干细胞试验，并成功检测了BPA和CdCl2的胚胎发育毒性。对该实验体系的进一步完善，将有利于提高EST的试用范围和检验效能。

目录

声明

摘要

前言

第1章 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 实验对象与受试物

1．1．2 实验仪器

1．1．3 实验试剂

1．1．4 主要试剂的配制

1．2 实验方法

1．2．1 小鼠胚胎干细胞的培养与传代

1．2．2 mES细胞细胞毒性试验

1．2．3 3T3细胞细胞毒性试验

1．2．4 mES细胞神经分化实验

1．2．5 免疫荧光实验检测神经细胞特性标志物的表达

1．2．6 mES细胞神经分化抑制试验

1．2．7 实时荧光定量PCR检测特异性标志物的表达

1．2．8 质量控制

1．2．9 代入预测模型判定胚胎发育毒性分级

1．2．10 统计学分析

第2章 结果

2．1 胚胎干细胞细胞毒性IC50 ES的测定

2．2 鼠胚成纤维细胞3T3细胞毒性IC50 3T3的测定

2．3 小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞方法的建立及鉴定

2．3．1 神经分化诱导时mES细胞的接种密度

2．3．2 神经细胞培养液培养时间

2．3．3 细胞分化过程中的形态学改变

2．3．4 免疫荧光实验检测神经细胞特性标志物的表达

2．4 小鼠胚胎干细胞神经分化抑制ID50 ES的测定

2．4．1 BPA胚胎干细胞神经分化抑制实验

2．4．2 CdCl2胚胎干细胞神经分化抑制实验

2．4．3 5-Fu胚胎干细胞神经分化抑制实验

2．4．4 Penicillin-G胚胎干细胞神经分化抑制实验

2．5 代入预测模型并判定毒性分级

第3章 讨论

3．1 胚胎干细胞诱导神经分化方法的探索

3．2 BPA的胚胎发育毒性的测定

3．3 CdCl2的胚胎发育毒性的测定

3．4 结果与方法评价

第4章 结论与展望

参考文献

综述 干细胞的分类及其应用

致谢

附录1 攻读硕士学位期间发表的文章

附录2 攻读硕士学位期间参加的科研项目