应用高通量PTT-ELISA和荧光素酶报告系统筛选无义突变通读诱导剂

摘要

目的:
　　筛选新型无义突变通读诱导剂，为无义突变所致肿瘤和遗传病治疗提供具有药物潜力的候选化合物。
　　方法:
　　用购自上海中科院生化细胞所化学文库的候选化合物各10μmol/L处理本课题组前期已建立的无义突变虫荧光素酶细胞模型，加入底物发光检测酶活性大小，初步筛选出能够通读无义突变虫荧光素酶的阳性通读剂。接着进一步应用无义突变虫荧光素酶细胞模型和PTT-ELISA方法鉴定其活性。最后用确认的通读活性阳性化合物处理人结直肠癌细胞株HT-29，检测无义突变APC基因mRNA及蛋白表达水平，分析下游β-catenin与c-myc基因蛋白表达，用细胞划痕实验、Transwell方法检测HT-29细胞迁移能力，MTT方法分析细胞生长速度，流式细胞术、TUNEL方法分析阳性化合物细胞毒性。
　　结果:
　　应用无义突变虫荧光素酶细胞模型初筛，初步发现灭瘟素具有无义突变通读活性，进一步经无义突变虫荧光素酶细胞模型和PTT-ELISA方法发现，随着灭瘟素浓度升高，虫荧光素酶mRNA及活性及蛋白表达水平不同程度上升，且相同浓度下，通读效果显著高于G418。在HT-29细胞中，灭瘟素同样可显著通读APC基因无义突变，且通读效率高于G418。研究还发现，灭瘟素通读无义突变APC基因后，APC基因下游β-catenin与c-myc基因蛋白表达也相应下降，HT-29细胞迁移能力降低，生长速度降低。流式细胞术及TUNEL凋亡结果表明，灭瘟素细胞毒性稍低于G418。
　　结论:
　　经无义突变虫荧光素酶细胞模型和PTT-ELISA方法发现了灭瘟素具有无义突变通读活性，能显著减轻肿瘤细胞恶性表型，可作为先导化合物进一步探讨其临床药用价值。

目录

声明

摘要

引言

1．1 实验材料

1．1．1 细胞模型试剂

1．1．2 主要实验设备及仪器

1．1．3 常用试剂的配制

1．2 实验方法

1．2．1 细胞内阳性化合物的筛选荧光素酶活性

1．2．3 Western blot 检测萤光素酶蛋白表达

1．2．4 细胞外的PT-ELISA 方法验证

1．2．5 实时定量PCR

1．2．6 western blot 法检测 APC 及下游蛋白的表达

1．2．7 Transwell迁移实验

1．2．8 细胞划痕实验

1．2．9 MTT方法检测细胞增殖能力

1．2．10 细胞凋亡流式细胞计数法

1．3 统计学处理

2 实验结果

2．1 无义突变虫萤光素酶细胞模型初筛结果

2．2 无义突变虫萤光素酶细胞模型验证结果

2．3 PTT-EL I SA方法阳性化合物验证结果

2．4 灭瘟素对HT-29细胞中无义突变APC基因的通读结果

2．5 细胞迁移实验结果

2．6 阳性通读化合物对细胞的凋亡作用

3 讨论

参考文献

综述

参考文献

致谢

附录1 攻读硕士学位期间发表的论文

附录2 攻读硕士学位期间参加的科研项目