Myocardin/mir-206/Connexin43信号通路在血管平滑肌细胞增殖及动脉粥样硬化中的作用

摘要

缝隙连接蛋白43(Connexin43，CX43)调控血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖过程中具有重要作用，myocardin是调控VSMCs分化的关键因子，miR-206是平滑肌细胞增殖的重要调控因子。那么myocardin、miR-206和CX43转录因子网络如何相互作用，影响VSMC分化与增殖？这种作用的分子机制如何？对AS疾病模型的具体作用又如何？对平滑肌细胞增殖相关基因转录因子网络的研究具有创新性，旨在找到亟待解决的动脉粥样硬化相关的基础问题的突破点。本文围绕myocardin/miR-206/connexin43通路在VSMCs增殖及对动脉粥样硬化疾病的作用展开了深入的研究。其内容如下:
　　1.通过细胞增殖实验等检测miR-206、CX43对人主动脉血管平滑肌细胞株(HA-VSMCs)增殖及表型转换的影响。实验结果表明，过表达miR-206显著抑制HA-VSMCs增殖状态及表型转换。转录水平干扰CX43表达明显抑制HA-VSMCs增殖状态及表型转换。荧光素酶报告实验证明miR-206与CX43-3’UTR通过特异性结合位点结合，调控CX43蛋白表达水平。
　　2.通过细胞增殖实验等检测过表达myocardin对HA-VSMCs增殖及表型转换和CX43、miR-206表达水平的影响。实验结果表明，myocardin显著抑制HA-VSMCs增殖状态及表型转换。过表达myocardin后CX43蛋白表达量明显降低，但mRNA水平无明显变化，而miR-206表达量显著升高。Myocardin不具有激活CX43启动子荧光素酶报告质粒的转录活性。荧光素酶报告实验和ChIP实验证明myocardin可直接与miR-206启动子结合，而突变miR-206启动子区的CArG结合位点，可明显抑制myocardin对miR-206启动子活性的上调作用，提示myocardin通过CArG结合位点结合miR-206启动子而调控miR-206表达。
　　3.构建mmu-miR-206及其对照慢病毒表达载体并包装收集病毒浓缩液，分组处理ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠，检测体重血脂水平。各组小鼠体重变化、甘油三酯水平和低密度脂蛋白水平无明显差异，mmu-miR-206-3p慢病毒颗粒侵染降低ApoE-/-小鼠总胆固醇水平，明显升高血清高密度脂蛋白（HDL）。采用HE染色、masson染色计算斑块病变面积比发现，mmu-miR-206-3p病毒颗粒侵染明显减少ApoE-/-小鼠动脉斑块病变面积及胶原纤维含量，但仍高于正常水平。Mmu-miR-206慢病毒侵染的小鼠血管组织中CX43表达水平明显降低。利用组织免疫荧光试验方法统计分析小鼠血管中的CX43表达阳性细胞数发现，在HA-VSMCs层发现CX43表达，ApoE-/-小鼠斑块病变区域表达增多，侵染miR-206病毒颗粒后CX43表达量明显减低。
　　本研究围绕myocardin/miR-206/CX43信号通路作用于HA-VSMCs增殖分化展开深入研究，发现其具有抑制增殖及表型转换的作用。miR-206在转录后水平下调CX43的蛋白表达，从而抑制HA-VSMCs细胞增殖及表型转换。过表达myocardin可有效下调血管平滑肌细胞增殖水平，抑制血管平滑肌细胞向增殖表型转换。体内实验表明miR-206可有效缩小动脉粥样斑块面积及胶原纤维沉积，延缓疾病进展，有效下调血管组织中的CX43蛋白水平，且伴随动脉粥样硬化斑块的缩小。另外还发现在ApoE-/-小鼠模型中过表达miR-206降低小鼠血清总胆固醇水平，上调高密度脂蛋白水平，具有防治动脉粥样硬化疾病的潜在价值。
　　Myocardin、miR-206调控缝隙连接蛋白的作用，这对防治慢性血管性疾病的研究具有重要意义。

目录

声明

摘要

第1章 miR-206调控CX43在血管平滑肌细胞表型转换的作用

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．2．1 材料

1．2．2 方法

1．3 结果

1．3．1 过表达miR-206明显抑制血管平滑肌细胞增殖

1．3．2 干扰CX43表达明显抑制血管平滑肌细胞增殖

1．3．3 miR-206抑制CX43表达抑制VSMCs增殖

1．4 讨论

第2章 Myocardin促进miR-206表达影响缝隙连接功能抑制平滑肌细胞增殖

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 结果

2．3．1 过表达myocardin明显抑制血管平滑肌细胞增殖

2．3．2 过表达myocardin明显抑制缝隙连接蛋白CX43表达

2．3．3 CX43启动子与myocardin荧光素酶报告实验

2．3．4 miR-206启动子与myocardin荧光素酶报告试验

2．3．5 ChIP实验验证myocardin与miR-206结合

2．4 讨论

第3章 miR-206／Connexin43表达对动脉粥样硬化的影响

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果

3．3．1 成功构建pLVO．1 -mmu-miR-206慢病毒质粒

3．3．2 病毒包装及病毒滴度测定结果

3．3．3 小鼠基本信息及体重监测

3．3．4 mmu-miR-206-3p对ApoE4-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响

3．3．5 各组小鼠血管组织中miR-206及CX43表达变化

3．4 讨论

第4章 结论与展望

综述

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果