新信号通路STAT-5B／HSP27／FGF-2在促凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖迁移中的作用

摘要

目的实验验证STAT-5参与凝血酶诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和迁移, FGF-2和Hsp27是此信号途径的下游效应分子。方法胰酶消化法分离大鼠VSMC,3-5代的细胞用于实验;Ad-dnSTAT-5A和Ad-dnSTAT-5B是C末端缺失的腺病毒重组子,Ad-dnSTAT-3和pad-dnHsp 27是点突变的腺病毒重组子;化学合成小干扰RNA技术(SiRNA)转染细胞敲减Hsp27表达;细胞迁移检测采用细胞刮伤模型;以细胞计数和[3H]-胸腺嘧啶标记的DNA合成实验表示细胞增殖;电泳迁移率实验(EMSA)测定DNA结合活性;报告基因氯霉素乙酰转移酶活性测定(CAT assay)用于检测启动子活性;ELISA试剂盒测定FGF-2分泌水平;免疫共沉淀和免疫共沉淀确定蛋白质相互作用。RT-PCR测定基因表达水平; Western-blot检测蛋白磷酸化白表达水平。结果凝血酶在VSMC激活STAT-5,STM-5的磷酸化水平增加1倍并有时间依赖性,通过腺病毒介导STST-5B,而不是STST-5A缺失体的过表达拮抗STST-5的功能可抑制凝血酶诱导的VSMC增殖和迁移;凝血酶诱导VSMC HSP27和FGF2的表达皇时间和STST-5B依赖性;此外小干扰RNA敲低HSP27表达水平或用腺病毒介导缺失体的过表达拮抗HSP27的功能均可消除凝血酶诱导的血管平滑肌细胞FGF2的表达及其增殖和迁移作用;免疫荧光实验显示凝血酶增强HSP27与F-actin的共定位,这一作用可被dnSTST5B抑制。凝血酶诱导下STST3TSTAT5B及STST5B-HSP27的结合增强。同时腺病毒介导STST-3缺失体的过表达可抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞HSP27和FGF2的表达及VSMCs的增殖和迁移。结论新发现的STST-5B／STST3／HSP27／FGF-2信号通路参与血管平滑肌细胞的增殖和迁移,可能在血管成形术后再狭窄等血管疾病的病理过程中发挥重要作用。