MRTF-A调控miR-1273g-3p对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制研究

摘要

目的:
　　在Aβ25-35诱导人源性SH-SY5Y损伤细胞上，筛选能差异化表达并与MRTF-A相关的miRNA，探讨MRTF-A介导miRNA对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制。
　　方法:
　　1.在Aβ25-35诱导SH-SY5Y损伤细胞模型中，用基因芯片筛选与MRTF-A调控相关的miRNA:建立细胞模型;细胞分组(control，Aβ25-35，MRTF-A，MRTF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后，给予40μmol/L Aβ25-35处理，24h后，用western blot方法检测MRTF-A的蛋白表达水平，并提取RNA。用Agilent RNA6000Nano/Pico Assay法检测各组RNA质量合格后，使用miRNA OneArray芯片技术分析各组中发生显著差异变化的miRNA。得到各组显著变化的miRNA，再通过各组间相互比较得到MRTF-A调控的miRNA。筛选出差异性表达最为显著的miRNA，并用RT-qPCR检测MRTF-A对目标miRNA的调控作用。
　　2.MRTF-A对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制:
　　1)MRTF-A对细胞自噬的影响:实验分为4组(control，Aβ25-35，MRTF-A，MRF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后，给予40μmol/L Aβ25-35处理24h，提取蛋白，检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
　　2)miR-1273g-3P对细胞自噬的影响:实验分为4组(miR-1273g-3p mimic control，miR-1273g-3p mimic,miR-1273g-3p mimic control+Aβ25-35,miR-1273g-3pmimic+Aβ25-35)。转染miR-1273g-3p48h后，给予40μmol/L Aβ25-35处理24h，提取蛋白检测LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
　　3)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p有关:实验分为5分组(control，Aβ25-35,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35）。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后，给予Aβ25-35处理24h后，提取蛋白，检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
　　4)miR-1273g-3p对靶基因mTOR的作用:采用mirwalk、targetscan软件预测其靶基因，并验证其对靶基因（自噬上游靶基因）mTOR表达的影响。实验分为2组（miR-1273g-3p mimic control，miR-1273g-3p mimic）;转染miR-1273g-3p mimic48h后，提取RNA和蛋白，分别检测mTOR蛋白表达水平。
　　5)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p抑制mTOR有关:实验分为5组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3pinhibitor control+Aβ25-35，MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后，给予40μmol/L Aβ25-35处理24h，提取蛋白，检测mTOR的蛋白表达水平。
　　结果:
　　1.基因芯片筛选miRNA:在给予Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中，MRTF-A蛋白表达水平明显降低，转染MRTF-A质粒使细胞过表达MRTF-A，将各组通过RNA质检的RNA进行miRNA基因芯片杂交，依据|Fold change|≧0.585且P-value＜0.05的条件筛选条件，共筛选出295个显著差异的miRNA。将得到的295个miRNA在各组间交集比较，共得到8个与MRTF-A调控相关的miRNA;其中上调的有miR-1273g-3p，下调的有hsa-miR-6772-3p、hsa-miR-6736-3p、hsa-miR-6740-3p、hsa-miR-7106-3p、hsa-miR-6747-3p、hsa-miR-6776-3p及hsa-miR-3653-5p。我们选择上调明显的miR-1273g-3p，用RT-qPCR验证显示MRTF-A能明显上调miR-1273g-3p的表达，与芯片结果一致。
　　2.MRTF-A调控miR-1273g-3p促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生:结果显示，在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中，过表达MRTF-A能明显增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达，说明MRTF-A促进经Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中，转染miR-1273g-3p mimic也能明显促进LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达，表明miR-1273g-3p也能够促进自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中，共转染MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达较单转MRTF-A有明显降低，提示miR-1273g-3p参与了MRTF-A促进自噬的的作用。
　　3.MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p，从而抑制其靶基因mTOR表达实现:利用mirwallk、Targetscan软件总共预测到1090个miR-1273g-3p靶基因，并找到负性调控自噬的靶基因mTOR。RT-qPCR和western blot结果显示，单转miR-1273g-3p能明显抑制了mTOR的mRNA和蛋白表达水平;另一方面，单转MRTF-A也能抑制mTOR的表达，而共转MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后能逆转MRTF-A对mTOR表达的上调，提示MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p，从而抑制其靶基因mTOR表达实现。
　　结论:
　　MRTF-A能够促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生，而miR-1273g-3p通过抑制mTOR的表达促进细胞自噬的发生;另一方面，MRTF-A能够上调miR-1273g-3p的表达，MRTF-A促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬可能与其上调miR-1273g-3p抑制mTOR的表达相关。

目录

声明

摘要

中英文对照表

前言

第一部分 基因芯片分析Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞中与MRTF-A相关的差异性表达miRNA

1 材料

1．1 细胞

1．2 细胞培养及相关试剂

1．3 摇菌和质粒提取试剂

1．4 RNA提取及Real-Time PCR检测试剂

1．5 实验仪器

2 方法

2．1 细胞培养

2．2 摇菌和质粒提取

2．3 质粒转染

2．4 细胞处理

2．5 MiRNA测序和生物信息学分析

2．6 Real-Time PCR检测

2．7 统计分析

3 结果

3．1 SH-SY5Y细胞模型的建立

3．2 RNA质检结果

3．3 基因芯片分析差异性表达的miRNA

3．4 miR-12739-3p差异表达验证

4 讨论

第二部分 MRTF-A调控miR-1273g-3p对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制研究

1 材料

1．1 实验细胞

1．2 处理试剂

1．3 RNA提取及Real-Time PCR检测试剂

1．4 Western Blot检测试剂

2 方法

2．1 细胞培养

2．2 质粒转染

2．2 分组处理

2．3 Western blot检测

2．4 Real-Time PCR检测

2．5 统计学分析

3 结果

3．2 miR-1273g-3p促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬

3．3 MRTF-A对自噬的上调效应与miR-12739-3p有关

3．4 miR-1273g-3p靶基因的预测

3．5 MRTF-A促进自噬可能是通过调控miR-1273g-3p抑制mTOR实现

4 讨论

结论

参考文献

综述 自噬在神经退行性疾病中的研究进展

致谢

附录