A型流感病毒感染诱导COX2基因表达机制研究

摘要

流感病毒是一种有高度传染性的正链RNA病毒，能对人的上呼吸道和下呼吸道上皮细胞进行感染。环加氧酶2(COX2)是非常重要的与许多疾病的发生密切相关的炎症因子，包括免疫反应、急性和慢性炎症、心血管疾病和癌症形成等，尤其抗病毒过程中具有非常重要的作用，同时COX2与其它抗病毒因子具有协同作用。本论文主要从表观遗传修饰变化和PKA信号通路激活两个方面对流感病毒上调COX2表达的机制进行了研究，并讨论了他们在COX2表达过程汇总的协作关系。接着，本文深入探究了参与表观遗传修饰的重要基因甲基转移酶DNMT3a和DNMT3b的在流感感染过程中的变化过程，进而通过对microRNA29家族研究，揭示了DNMT3a和DNMT3b表达量下调的分了机制。最后，本文在多层次验证了COX2表达对抗病毒基因IL29的调控功能。 我们在A549细胞系和PBMC细胞中均证明了A型流感病毒可以诱导COX2的表达。进而我们对直接影响表观遗传修饰的重要基因DNMT家族的三个成员DNMT1，DNMT3a和DNMT3b在流感感染过程中的表达变化及其与COX2基因表达变化的关系进行了深入研究。研究发现，DNMT3a和DNMT3b在感染早期都存在较大幅度的下调，相应的导致COX2基因表达的上升，并且此二者之间存在明显的相关性。 为了揭示表观遗传修饰在COX2表达中的具体作用位点，我们用对流感感染过程中COX2启动子进行了DNA甲基化分析。该结果显示，流感病毒感染后COX2启动子甲基化水平降低，并且关键转录位点CRE发生去甲基化。我们进步研究了甲基转移酶在启动子表观遗传修饰中的作用。通过ChIP实验，我们证明了DNMT3a和DNMT3b与启动子特定区域结合力降低导致CRE转录位点内的CpG去甲基化，并且提高CREB蛋白的结合能力，从而导致COX2基因表达上调。 接下来，为了深入研究甲基转移酶DNMT3a和DNMT3b下调的机制，通过查阅文献我们发现一个mi croRNA家族——miR29a，b和c直接定位于DNMT3a和3b上。通过进一步研究，我们发现m RR29a，b，c均能有效抑制DNMT3a和3b的表达。然后我们检测了miR29b在流感感染的A549细胞系，PBMC细胞和病人血样中的表达水平并发现此三者中mR29b均有明显的上调。这在一定程度上揭示了DNMT表达发生变化的原因。 然后，我们利用特异性小分子干扰RNA和信号通路抑制剂对流感病毒诱导COX2表达过程中涉及到的关键的信号通路进行了筛选。结果发现流感病毒主要是通过PKA CREB信号通路来激活COX2的表达，并且CREB蛋白磷酸化对CREB蛋白结合去甲基化的CRE，进而开启COX2表达起到了至关重要的作用。 最后，我们发现在甲型H1N1流感病毒感染的患者血清中，COX2下游产物PGE2和新发现的抗病毒基因IL29均有明显的上调。为证实两者间的相关性，通过启动子筛选，我们发现COX2对IL29的表达有明显的诱导作用。通过过表达COX2基因和COX2抑制剂实验，我们进一步证实了了COX2表达对抗病毒基因IL29的表达有明显的促进作用。 综上所述，流感病毒激活COX2的表达是一个很复杂的过程，在这个过程中miRNA29家族的上调导致甲基转移酶DNMT3a和3b表达量下调，并造成COX2基因的表观遗传修饰发生改变，其中包括COX2启动子整体甲基化水平降低以及CRE位点去甲基化。另外还发现PKA信号通路被激活，并造成CREB蛋白磷酸化，使CREB与去甲基化的CRE位点结合能力增强。除此外，还发现了COX2对抗病毒基因IL29有诱导作用并可能通过这条途径直接抑制流感病毒的复制。

目录

声明

摘要

第一部分综述

1．1流感病毒概述

1．1．1流感的过去和现在

1．1．2流感病毒的基因背景

1．2基因的表观遗传修饰与DNA甲基转移酶(DNMT)家族

1．2．1基因的表观遗传修饰概述

1．2．2 DNA甲基转移酶家族

1．2．3表观遗传修饰与基因转录

1．3 MicroRNA与基因表达的调控

1．3．1 MicroRNA概述

1．3．2病毒与miRNA

1．3．3 miR29与表观遗传修饰

1．4环加氧酶2(COX-2)与炎症网络

1．4．1环加氧酶2概述

1．4．2环加氧酶2(COX-2)与炎症网络

1．5干扰素λ1(白介素29，IL29)与流感病毒

1．5．2干扰素λ1的抗流感病毒功能

1．6流感病毒感染与细胞因子风暴

第二部分流感病毒诱导COX2表达的机制研究

前言

第一章流感病毒感染引起的表观遗传修饰与COX2的表达

2．1．1实验材料

2．1．2实验方法

2．1．3实验结果

2．1．4讨论

第二章流感病毒引起的甲基化水平改变的机制研究

2．2．1实验材料

2．2．2实验方法

2．2．3实验结果

2．2．4讨论

第三部分COX2上调干扰素λ的机制研究

前言

3．1．1实验材料

3．1．2实验方法

3．1．3实验结果

3．1．4讨论

第二章COX2通过增强NF-κB增强子结合能力促进干扰素λ1表达

3．2．1实验材料

3．2．2试验方法

3．2．3实验结果

3．2．4讨论

参考文献

致谢