乙肝病毒捕获细胞因子和信号级联以逃避宿主免疫并维持持续感染

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致肝脏疾病的主要原因，从爆发性肝炎到肝硬化阶段，最终发展成肝癌(HCC)。本研究致力于研究乙肝病毒与胶原三螺旋重复蛋白1(CTHRC1)之间的关系。CTHRC1是一个多功能的分泌蛋白，与癌症细胞的侵袭和迁移具有紧密联系。然而，关于CTHRC1调节病毒复制方面还没有研究和报道。我们的研究将弄清楚HBV诱导CTHRC1表达和反过来CTHRC1影响HBV复制的调节机制。 我们研究确定了HBV感染对CTHRC1表达的影响。首先，我们检测到153例慢性乙肝病人血清中的CTHRC1蛋白水平比164例健康人高。其次，数据显示12份HBV相关肝癌组织中CTHRC1mRNA水平比13份癌旁组织高。再者，Elisa结果显示142份HBV感染病人的血清中CTHRC1蛋白水平与HBV DNA载量显著相关。另外，我们还在转染HBV基因组的HepG2细胞和携带HBV基因组的HepG2.2.15中检测了CTHRC1蛋白水平。因此，我们总结出:HBV感染的病人和携带HBV基因组的肝癌细胞中CTHRC1表达被激活。 我们进一步探索HBV激活CTHRC1表达的分子机制。研究发现CTHRC1启动子活性、mRNA和蛋白产量都被甲基转移酶(DNMT)的抑制剂5'-aza-dc所下调，提示DNMT在CTHRC1被激活过程中发挥重要作用。基因组甲基化测序分析显示肝癌组织中的CTHRC1启动子的甲基化程度高于癌旁组织。进一步还发现CTHRC1启动子活性、mRNA和蛋白表达都被甲基转移酶3a(DNMT3a)所抑制，但却被siDNMT3a所激活，说明DNMT3a介导CTHRC1的表达。 接下来我们首次探究CTHRC1对HBV复制的影响。在HepG2、HepG2.2.15和L02细胞中，HBV e抗原(HBeAg)、HBV s抗原(HBsAg)和HBV DNA表达与CTHRC1基因呈现时间和剂量依赖，但却被siCTHRC1所抑制。HBV的4.1/3.5kb和2.4/2.1kb特定转录本活性同样被CTHRC1基因增强，被siCTHRC1所削弱。总结以上结果我们得出过表达CTHRC1激活HBV复制，敲出CTHRC1基因抑制HBV复制。 为了揭示CTHRC1调控HBV复制的分子机制，我们评估信号通路在此调节中的作用。结果显示HBeAg和HBsAg表达被CTHRC1激活，却被MEK1/2的抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125和PKC抑制剂GF109203所抑制，说明PKC、ERK和JNK信号通路参与CTHRC1调控HBV复制。更深入的研究发现HBeAg和HBsAg表达被CTHRC1上调，却被si-c-Jun所抑制;而且免疫共沉淀结果显示p-c-Jun与HBV基因组上的AP1位点结合。总结上述结果，我们证明了PKC、ERK、JNK和c-Jun介导CTHRC1调控的HBV复制。 我们知道干扰素反应能够强烈抑制HBV复制，因此，我们探究CTHRC1调节干扰素的抗病毒活性方面的功能。实验结果显示HBeAg、HBsAg和HBV DNA表达量分别被IFN-α（Ⅰ型干扰素）、IFN-γ(Ⅱ型干扰素)和IFN-λ1(Ⅲ型干扰素)所下调，但这种抑制效应却被CTHRC1基因所削弱。进一步研究显示IFN-α激活IFN-α/β受体(IFNARα/B)和干扰素诱导基因(PKR、Mx1和OAS1)和磷酸化STAT1/2，但却被CTHRC1抑制。除此之外，CTHRC1还促进IFNARα的磷酸化和泛素化，但被GF109203和U0126所抑制。因此，我们总结出CTHRC1促进HBV复制是通过激活PKC/ERK/JNK/c-Jun信号级联反应以抑制IFN/JAK/STAT通路的抗病毒活性。 综上所述，HBV通过表观修饰和转录调节的方式激活CTHRC1表达，CTHRC1反过来帮助HBV复制则是通过激活PKC/ERK/JNK/c-Jun信号级联反应、减弱IFN/JAK/STAT通路活性和加快IFN-α/β降解。因此，我们揭示了一个新的机制:HBV捕获细胞因子和信号级联以逃避宿主免疫和维持持续感染。除此之外，我们还发现了HBV感染肝细胞过程中CTHRC1的一个新功能。

目录

声明

摘要

第一章：研究背景和基础

1．1．1乙肝病毒的发现和乙型肝炎的流行

1．1．2HBV结构及基因组情况

1．2胶原三螺旋重复蛋白1(CTHRC1)

1．2．2 CTHRC1蛋白调控血管重塑

1．2．4 CTHRC1促进癌细胞侵袭和转移

1．3 DNA甲基化

1．3．1 DNA甲基化机制

1．3．2 DNA甲基转移酶

1．3．3 DNA甲基转移酶高表达与癌症的关系

1．3．4抑制DNMTs作为抗癌治疗策略

1．4干扰素(IFN)

1．4．1Ⅰ型干扰素的生物学效应

1．4．2 IFN信号通路

1．4．3Ⅰ型干扰素临床治疗病毒性疾病

1．4．4新干扰素

第二章：CTHRC1表达与病毒性乙型肝炎的相关性

2．1实验材料

2．1．1研究对象

2．1．2菌种、质粒和细胞

2．1．3实验试剂

2．1．4引物

2．1．5统计学分析

2．2实验方法

2．2．1组织中总RNA的提取

2．2．2 RT-PCR反应

2．2．3 Real-time PCR反应

2．2．4细胞样本Western Blot检测

2．2．5 ELISA检测血清中CTHRC1蛋白表达量

2．3实验结果

2．3．2乙肝病毒诱导肝癌细胞系CTHRC1的表达

2．4讨论

第三章：HBV感染诱导CTHRC1基因表达的机制

3．1实验材料

3．1．1细胞和质粒

3．1．3引物

3．2实验方法

3．2．1细胞复苏、传代和冻存

3．2．2 pGL3-CTHRC1-luc质粒构建

3．2．3 DNA片段酶切、回收、连接和转化

3．2．4筛选鉴定阳性克隆

3．2．5荧光素酶活性测定

3．2．6甲基转移酶活性测定

3．2．7 DNA甲基化测序

3．3实验结果

3．3．1CTHRC1基因表达受到甲基化水平的调控

3．3．2DNMT3a主要参与HBV调控的CTHRC1基因表达

3．4讨论

第四章：CTHRC1基因对HBV复制的影晌

4．1实验材料

4．1．2引物

4．1．3实验试剂

4．2实验方法

4．2．2HBeAg/HBsAg酶联免疫分析

4．2．3 Northern blot检测HBV RNA

4．2．4 HBV capsid-associated DNA检测

4．3实验结果

4．3．2干扰CTHRC1基因抑制HBV复制

4．4讨论

第五章：CTHRC1调控HBV复制的信号通路研究

5．1实验材料

5．1．3相关试剂和抗体

5．2实验方法

5．2．1染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,CHIP)

5．2．2细胞核、质蛋白抽提

5．2．3免疫荧光

5．3实验结果

5．3．1PKCa\ERK\JNK信号通路介导CTHRC1调控HBV复制

5．3．2 CTHRC1基因激活PKCa\ERK\JNK信号通路

5．3．3 CTHRC1基因通过PKCa\JNK通路使p-c-Jun入核

5．4讨论

第六章：CTHRC1阻碍抗病毒反应及机制研究

6．1实验材料

6．1．1质粒、试剂和抗体

6．2．1免疫沉淀(IP)实验

6．2．2动物实验

6．3实验结果

6．3．1 CTHRC1基因抑制干扰素信号通路

6．3．2 CTHRC1基因通过PKC\ERK通路抑制干扰素受体

6．3．3 CTHRC1基因促进小鼠体内HBV复制

6．4讨论

第七章：研究总结

参考文献

研究生期间发表和代发表的论文

致谢