YAP1对ATDC5前软骨细胞分化的影响及其调控机制

摘要

大部分骨的线性增长和骨折后的组织修复过程是通过软骨内成骨完成的，这些复杂的生理过程被大量激素、生长因子、转录因子精密调控着。YAP1(Yes相关蛋白1)转录共激活因子是Hippo通路下游的效应因子，Hippo通路参与调控细胞增殖、分化和凋亡过程。近年来有研究发现，YAP1在软骨、骨发育过程中发挥着重要作用，但YAP1调控软骨细胞分化的分子机制还有待阐明。因此，我们的实验设计如下。 YAP1在前软骨细胞系(ATDC5)中的表达，对其体外增殖、分化的影响及机制研究 第—部分 YAP1在ATDC5中的表达 实验一:YAP1在ATDC5中的表达及其位置变化 目的:观察YAP1在ATDC5细胞中具体表达位置，以及细胞密度对于YAP1表达位置的影响。 方法:1、ATDC5细胞系培养。2、细胞免疫荧光检测YAP1的表达。3、不同细胞密度接种ATDC5细胞，对比荧光位置与亮度。 结果:免疫荧光图片显示YAP1蛋白在ATDC5细胞中显著表达，主要表达于细胞核内。细胞密度较低时，YAP1蛋白在ATDC5胞核内表达较高。细胞密度增加，YAP1蛋白核内表达量相对减少。 第二部分 YAP1在ATDC5细胞增殖，软骨向、肥大向分化中的作用 实验一:YAP1在ATDC5细胞软骨向、肥大向诱导分化中表达的变化 目的:YAP1基因在ATDC5细胞软骨向、肥大向分化中表达变化趋势。 方法:1、ATDC5细胞诱导分化。2、RNA提取，逆转录，qRT-PCR检测YAP1与TAZ的mRNA表达变化。 结果:ATDC5细胞成软骨向诱导分化过程中，YAP1mRNA的表达量在第2、4天明显增高，后降低。其同源物TAZ表达量逐渐降低。 实验二:构建YAP1基因过表达和沉默的ATDC5细胞系 目的:在ATDC5细胞中过表达或者沉默YAP1基因。 方法:1、购买YAP1稳定转染质粒，293E细胞进行病毒包装，病毒上清液感染ATDC5得到三组细胞:对照组(pLK0.1-mouse-scrambled)，YAP1过表达组(PLX304-human-YAP1-V5),YAP1沉默组(pLK0.1-mouse-SHYAP1)。2、qRT-PCR和Western blot检测YAP1过表达或沉默效率。 结果:筛选出了YAP1基因稳定过表达和沉默的ATDC5细胞系。qRT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平验证了YAP1确实被外源性过表达与内源性敲低。 实验三:YAP1对ATDC5增殖、软骨向和肥大向分化的影响 目的:观察YAP1对ATDC5增殖、软骨向和肥大向分化的影响。 材料和方法:1、MTT细胞增殖实验。2、诱导细胞分化，qRT-PCR和Western blot检测软骨向分化基因(COL2A1、SOX9)和肥大向分化基因(COL10A1、ALP、RUNX2)的表达差异。3、阿尔新蓝染色、ALP染色与ALP活性实验比较三组细胞分化差异。4、微团培养条件下，qRT-PCR及其阿尔新蓝染色检测三组细胞间软骨基质的形成差异。 结果:过表达YAP1使ATDC5增殖速度加快，而沉默组增殖速度降低。qRT-PCR结果表明，过表达组COL2A1、SOX9mRNA表达量于第4、7均明显降低;ALP和RUNX2表达量于14天也明显降低。沉默组COL2A1mRNA表达量子第7天升高;COL10A1和ALP表达量于第7、14天也明显升高。阿尔新蓝染色、ALP阳性染色面积和ALP活性定量同样说明过表达组减少，沉默组增多。同时，体外微团三维培养ATDC5细胞，第6天的qRT-PCR与阿尔新蓝染色结果与二维培养结果一致。 第三部分 YAP1调控ATDC5分化的作用机制 实验一:YAP1调控ATDC5分化的作用机制的初步研究 目的:检测YAP1对Wnt/β-catenin信号通路的影响。 方法:1、转入TCF/LEF报告质粒，双荧光素酶实验检测YAP1对其转录活性的影响。2、Western blot检测YAP1对Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白(磷酸化GSK-3β、总GSK-3β、DKK1、β-catenin)的影响。 结果:过表达YAP1使β-catenin/TCF/LEF信号转录活性提高到对照组的1.8倍，而沉默YAP1明显降低了其转录活性。同时，YAP1过表达组中，磷酸化的GSK-3β以及β-catenin蛋白表达量的增多，DKK1表达量的减少，一致地说明该通路被激活。 实验二:YAP1调控ATDC5分化的作用机制的进一步研究 目的:证明YAP1通过Wnt/β-catenin信号通路调控了ATDC5分化过程。 方法:YAP1过表达组诱导分化过程中，加入Wnt通路抑制剂DKK1，或者YAP1过表达组细胞瞬转小鼠β-catenin的siRNA，诱导分化7天后，检测对照组、过表达组、过表达+DKK1组（或过表达+siRNA组）的SOX9、COL2A1、COL10A1的mRNA表达差异。同时，对三组细胞进行ALP染色。 结果:YAP1过表达导致的ATDC5分化能力的降低可以被β-catenin通路抑制剂DKK1部分恢复，β-catenin内源性敲低也能起到同样的逆转效果。 结论:该研究证明了YAP1抑制了ATDC5细胞的分化，并发现YAP1激活了Wnt/β-catenin信号通路。当抑制该通路时，可以部分逆转YAP1对于ATDC5细胞分化的抑制作用。同时，基因修饰细胞也许能为骨缺损修复再生提供一定的治疗策略。

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主要缩略词表

摘要

引言

文献综述 Hippo信号通路和YAP1的研究进展

第—部分YAP1在ATDC5中的表达

实验一：YAP1在ATDC5中的表达及其位置变化

第二部分Y1P1在ATDC5细胞增殖，软骨向、肥大向分化中的作用

实验一：YAP1在ATDC5细胞软骨向、肥大向诱导分化中表达的变化

实验二：构建YAP1基因过表达和沉默的ATDC5细胞系

实验三：YAP1对ATDC5增殖、软骨向和肥大向分化的影响

第三部分YAP1调控ATDC5分化的作用机制

实验一：YAP1调控ATDC5分化的作用机制的初步研究

实验二：YAP1调控ATDC5分化的作用机制的进一步研究

讨论

全文总结

参考文献

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