中药活性成分黄芩苷促进毛发生长的相关机制研究

摘要

目的： 毛囊是哺乳动物重要的皮肤附属器官，其形态形成大致分为:诱导期、器官形成期、细胞分化期三个阶段。在诱导期来自于间质细胞的Wnt/β-catenin信号诱导其上的上皮细胞形成基板，反过来上皮的基板诱导其下方的真皮细胞形成凝集层。毛囊在器官形成期和细胞分化期，上皮与间质细胞之间的多种复杂信号交互促使了毛囊形态结构的逐渐形成，真皮及上皮细胞大量分化增殖完善了毛发的主要结构:毛乳头、毛球、真皮结缔组织鞘、外毛根鞘、内毛根鞘、毛干、毛囊隆突、立毛肌和皮脂腺。随后，开始了毛发生长周期性的循环——生长期、退行期、休止期。 毛囊的正常发育和周期性的再生依赖于上皮细胞与间质细胞之间的相互作用。目前认为，虽然在两大类细胞之间的信号传递是相互的，但真皮细胞是上皮细胞反应的诱导者，毛囊真皮乳头细胞的活性是诱导和维持毛囊生长状态的关键因素。研究证实碱性磷酸酶(ALP，alkaline phosphatase)、多功能蛋白聚糖(Versican)、丝氨酸蛋白酶(Corin)、CD133和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是毛囊真皮乳头细胞的分子标记物。 毛囊的免疫赦免(IP，immune privilege)是周期性的、相对的赦免状态，研究表明其仅存在于毛囊的生长期，其中的一种机制是在人类和小鼠生长期的毛囊局部分泌强有效的免疫抑制剂(immunosuppressants):α-MSH、TGF-β1、TGF-β2、ACTH、IGF-1、IL-10等，而且这些自分泌的细胞因子和激素表达水平在生长期毛囊的皮肤中处于最高峰，对于恢复和维持毛发的免疫赦免至关重要。 中药以其毒副作用小、价格便宜及易于获得显示出巨大的优势和理想的应用前景，寻找、筛选安全有效的中药是优先的选择方向和任务。文献报道显示，用于毛发生长中药种类不多，大部分的研究均未阐明其中具有疗效的物质基础。黄芩是中医治疗脱发常用的组方药之一，黄芩苷是其主要活性成分，既往研究发现黄芩苷有提高机体免疫功能、抗氧、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒和促进毛囊生长等作用。但其调节毛发生长机制仍然缺乏深入的探讨。 本研究分两个部分:1.在BALB/c-nu裸鼠背部建立小鼠毛囊重构模型，模拟小鼠毛囊形态形成和周期性生长过程，在毛发生长期外用黄芩苷检测其对毛囊Wnt/β-catenin信号通路的激活效应以及对毛囊真皮乳头细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。2.在C57/BL6小鼠背部通过脱毛建立诱导的毛发生长期模型，局部用黄芩苷处理，检测其对毛囊免疫赦免因子α-MSH、TGF-β1、IGF-1分泌的影响。 方法与结果： 1.取0-1日龄C57BL/6小鼠完整皮肤，胰酶消化过夜，无菌条件下用眼科剪和镊子分离真皮和表皮，分别经过胶原酶消化和剪切、吹打制备成单个真皮和表皮细胞，两者按1∶1比例混合后移植到植入硅胶小室的免疫缺陷裸鼠背部，1周后取出小室顶盖，裸露创面。2周后移植部位有黑色毛发长出，黄芩苷治疗组、米诺地尔阳性对照组分别给予50μmol、100μmol黄芩苷和100μmol米诺地尔溶液100μl局部滴加，空白对照组给予100μl溶媒剂处理，Wnt/β-catenin通路抑制剂IWR-1组给予100μmol黄芩苷+1μmol IWR-1局部滴加，治疗期间观察毛发的生长情况。治疗14天后处死小鼠获取皮肤标本，应用计数毛囊和HE染色检测毛囊生长状态，组织化学(histochemistry)、实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、免疫蛋白印迹方法(Western-blotting)检测经典Wnt/β-catenin通路相关蛋白Wnt3a、Wnt5a、frizzled7、disheveled2、GSK3β、β-catenin、LEF1和真皮乳头细胞碱性磷酸酶ALP的表达。黄芩苷治疗组、阳性对照组与空白对照组、Wnt通路抑制剂IWR-1组相比较，肉眼观察毛发生长更浓密、粗壮，而Wnt通路抑制剂IWR-1组几乎没有毛发生长;Wnt3a、Wnt5a、frizzled7、disheveled2、β-catenin、LEF1及ALP在毛囊组织表达明显升高，GSK3β的表达明显降低，差异有显著性;治疗组与阳性对照组比较差异无显著性，但空白对照组与Wnt/β-catenin通路抑制剂IWR-1组比较差异有显著性;毛囊计数、HE染色显示治疗组和阳性对照组毛囊数目及毛干明显增多、增长。 2.用松香和石蜡按1∶1的比例混合融化后涂于C57/BL6小鼠背部脱毛，建立诱导的小鼠生长期毛发模型。脱毛第2天开始，黄芩苷治疗组、阳性对照组和空白对照组分别局部滴加100μl黄芩苷（100μmo1）、100μl米诺地尔（100μmol）、100μl溶媒剂，疗程17天，期间每天拍照记录毛发的生长情况。第19天处死小鼠，获取标本并在再生毛发部位随机拔毛（10根/小鼠）测量长度。应用ICH、ELASA、qPCR和Western-blotting检测局部皮肤组织中毛囊免疫赦免因子α-MSH、TGF-β1和IGF-1的表达。直接观察显示治疗组和阳性对照组毛发密集、毛色更深，毛干测量长度结果示治疗组和阳性对照组比空白对照组长，差异有统计学意义。HE染色结果显示治疗组和阳性对照组毛囊体积大于空白对照组。局部组织中α-MSH，TGF-β1，IGF-1的表达:治疗组和阳性对照组高于空白对照组，差异有显著性;治疗组和阳性对照组比较差异无统计学意义。 结论： 1.黄芩苷通过激活毛囊经典Wnt/β-catenin通路和增加毛囊真皮乳头细胞活性促进毛发生长，黄芩苷激活毛囊Wnt/β-catenin信号通路可能是通过作用于胞浆中Axin/CK1α/APC/GSK3β复合体上游分子而发生。 2.黄芩苷促进生长期局部组织毛囊免疫赦免因子α-MSH，TGF-β1，IGF-1的分泌，参与生长期毛囊免疫赦免状态的调节，因此毛囊更早地进入生长期，生成更长的毛干。

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摘要

英文缩略词表

引言

第一部分黄芩苷对小鼠毛囊经典Wnt／β-catenin信号通路及真皮乳头细胞活性影响研究

材料和方法

实验结果

讨论

本部分结论

第二部分黄芩苷对毛囊免疫赦免状态的调节作用

材料和方法

实验结果

讨论

本部分结论

全文结论

参考文献

综述

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