褪黑素对哮喘小鼠CD4+T淋巴细胞免疫功能影响的实验研究

摘要

目的：通过使用卵清蛋白(OVA)致敏方法建立支气管哮喘小鼠动物模型，设立不同的实验对照组，探讨褪黑素(MT)对哮喘小鼠CD4+T淋巴细胞免疫功能的影响及其作用机制。
　　方法：选择40只6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分为正常对照组、哮喘组、褪黑素组、地塞米松(DXM)组，每组10只。采用卵清蛋白致敏方法建立支气管哮喘小鼠动物模型。药物治疗组以褪黑素及地塞米松溶液腹腔注射；正常对照组与哮喘组以等量生理盐水腹腔注射。各组小鼠末次雾化吸入24 h内，苏木素-伊红(HE)染色观察气道炎症浸润情况；支气管肺泡灌洗液(BALF)瑞氏染色计数炎性细胞及嗜酸性粒细胞(EOS)；流式细胞术(FCM)检测各组小鼠外周血中CD4+T淋巴细胞数目；酶联免疫吸附法(ELISA)测定外周血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的水平；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺组织中T-bet、ROR-γt、GATA3、 Foxp3mRNA表达水平的含量。
　　结果：(1)成功建立哮喘小鼠动物模型，各组小鼠肺组织病理学观察发现正常对照组结构清晰，各级支气管上皮完整，肺泡间隔正常，基本无炎症细胞浸润；哮喘组小鼠支气管黏膜增厚，皱襞增多，管腔明显狭窄， 气道上皮损伤、脱落明显，气道内可见黏液栓，气道周围组织疏松水肿，细支气管及伴行血管周围有大量炎症细胞浸润，肺间质及肺泡腔内可见嗜酸性粒细胞，杯状细胞增生；褪黑素组和地塞米松组与哮喘组相比，支气管和血管周围炎症明显减轻，与对照组比较，无明显差异。(2)与正常对照组相比较，哮喘组气道炎症、BALF中炎症细胞总数和EOS细胞计数、外周血中CD4+T淋巴细胞数目、血清中IL-4水平以及肺组织中ROR-γt、GATA3mRNA蛋白表达水平明显增高(p<0. 05)，血清IL-2和IFN-γ水平以及肺组织中T-bet、Foxp3mRNA蛋白表达水平明显降低(p<0. 05)。与哮喘组比较，治疗组气道炎症、BALF细胞计数和EOS细胞计数、外周血中CD4+T淋巴细胞数目、血清中IL-4水平以及肺组织中ROR-γt、GATA3mRNA蛋白表达水平均明显降低(p<0. 05)，而血清IL-2和IFN-γ水平以及肺组织中T-bet、Foxp3mRNA蛋白表达水平明显增高(p<0. 05)。两治疗组比较， T-bet、Foxp3mRNA蛋白表达水平有统计学差异，余各项指标无明显差异(p>0. 05)。
　　结论：(1)褪黑素可抑制哮喘小鼠的气道炎症，其抑制作用可能与抑制炎症细胞和EOS细胞的表达有关。(2)褪黑素有效减少哮喘小鼠外周血CD4+T淋巴细胞数目，并能改善外周血清中IL-2、IL-4和IFN-γ水平及肺组织中T-bet、ROR-γt、GATA3、Foxp3mRNA表达水平的失衡，褪黑素有效减轻哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性可能是通过对这些炎症细胞及因子的调节起作用，在哮喘的防治中有良好的应用前景。

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英文缩略词表

引言

材料与方法

1.1 仪器和设备

1.1.1实验动物

1.1.2主要试剂

1.1.3仪器和设备

1.2 实验方法

1.2.1动物分组

1.2.2主要溶液的配制

1.2.3小鼠哮喘模型的建立

1.2.4实验动物标本取材

1.2.5肺泡灌洗液（BALF）炎症细胞总数及嗜酸性粒细胞计数

1.2.6肺组织病理学染色及分析

1.2.7外周血 CD4+T淋巴细胞检测

1.2.8血清中IL-2、IL-4和IFN-γ水平检测

1.2.9 RT-PCR方法测定肺组织中T-bet、ROR-γt、Gata3、 Foxp3 mRNA表达水平

1.3 统计学方法

结果

第一部分 哮喘小鼠模型的建立及肺组织病理学观察

第二部分 各组小鼠气道炎症比较

第三部分 外周血CD4+T淋巴细胞数目变化

第四部分 外周血清中IL-2、IL-4和IFN-γ水平变化

第五部分 肺组织中T-bet、ROR-γt、Gata3、 Foxp3 mRNA表达水平变化

5.1提取的总RNA电泳图像：

5.2 肺组织中T-bet、ROR-γt、Gata3、 Foxp3 mRNA表达水平

讨论

小结

参考文献

综述

致谢

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著