木瓜提取物对脂肪性肝纤维化小鼠的预防保护作用及机制研究

摘要

目的：利用高脂饮食联合腹腔注射猪血清建立小鼠脂肪性肝纤维化模型，在此模型的基础之上，研究木瓜提取物对小鼠肝脏的预防保护作用，初步探究其抗脂肪性肝纤维化的作用机制。
　　方法：取雌雄各半的BABL/C小鼠48只，4-6周龄，将其随机分为四组，每组12只，即正常对照组，模型组对照组，木瓜提取物低（100mg·kg-1）、高（300mg·kg-1）剂量组。除了正常对照组给予普通饲料外，其余各组均给予高脂饲料造模，与此同时，木瓜提取物低、高剂量组分别给予100mg·kg-1、300mg·kg-1木瓜提取物灌胃，持续10周。除了正常对照组以外，其余各组小鼠均从第五周开始腹腔注射猪血清，持续3周。末次给药并禁食12h后，称取并记录小鼠最终的体重，将其处死。(1)每周记录上述各组小鼠的体重，每日观察并记录小鼠饮食、饮水量，行为及形态变化，处死后，观察并记录肝脏组织的形态和重量变化。(2)测定小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性和甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、总胆汁酸（TBA）的含量。(3)采用羟脯氨酸试剂盒检测肝组织羟脯氨酸的含量。(4)小鼠肝脏HE染色，光镜下观察肝脏的病理学变化。(5)小鼠肝脏Masson染色法，光镜下观察肝组织的纤维化严重程度。(6)小鼠肝脏电镜观察肝组织的超微结构的变化。(7)PCR技术观察木瓜提取物对肝组织COL1A1、TIMP-1、α-SMA、IRE1、ATF6及eIF2α基因表达的影响。(8)Western Blot技术观察木瓜提取物对肝组织COL1A1、IL-1β、TNF-α、GRP78、JNK、p-JNK、GSK-3β、p-GSK-3β、p-AMPK、SIRT1、SIRT3及PGC-1α蛋白表达的影响。
　　结果：(1)与正常对照组相比，模型对照组均能显著地升高小鼠每日摄食量、饮水量、每周体重、终体重、净增长体重、体重增长率、肝重及肝指数，说明模型成功，木瓜提取物低、高剂量组均能改善小鼠的一般情况；肝脏取材外观观察比较发现模型对照组相较于鲜红、表面光滑无颗粒、界限清晰的正常对照组，其色浅偏白、表面粗糙有细小白色颗粒，木瓜提取物低、高剂量组小鼠肝脏外观有明显改善，接近于正常。(2)血清肝功能检测中，木瓜提取物低、高剂量组均能在一定程度上降低ALT、AST的活性和TG、LDL、TBA的含量（P<0.05），升高HDL的含量（P<0.05）。(3)木瓜提取物低、高剂量组的肝组织中羟脯氨酸含量明显减少（P<0.05）。(4)HE染色光镜下观察发现，木瓜提取物低、高剂量组小鼠肝脏小叶结构清晰，肝索排列较整齐，在中央静脉周围呈放射状排列，肝细胞脂肪变性和炎性细胞的数量均显著减少。(5)Masson染色光镜下观察发现，木瓜提取物低、高剂量组明显的抑制了胶原纤维的产生，仅见少量的或者细小的蓝色纤维穿梭在小血管周围。(6)投射电镜观察发现，木瓜提取物低、高剂量组的肝细胞中脂滴明显减少，内质网、线粒体等细胞器数量增多。(7)木瓜提取物低、高剂量组可以明显的降低COL1A1、TIMP-1、α-SMA、IRE1、ATF6及eIF2α基因的表达。(8)木瓜提取物低、高剂量组能明显的降低COL1A1、IL-1β、TNF-α、GRP78、p-JNK、p-GSK-3β蛋白的表达和升高GSK-3β、p-AMPK、SIRT1、SIRT3及PGC-1α蛋白的表达。
　　结论：
　　1.高脂饮食（10周）联合腹腔注射猪血清（3周）可建立稳定的小鼠脂肪性肝纤维化模型，本方法成熟可靠，简单易行；
　　2.木瓜提取物可改善脂肪性肝纤维化小鼠的肝功能、肝组织病理学改变及肝脏纤维形成的情况，对脂肪性肝纤维化具有预防保护作用；
　　3.木瓜提取物抑制脂肪性肝纤维化的作用机制可能与其调节SIRT1/SIRT3通路，改善内质网应激，抑制炎症反应，从而抑制胶原纤维的合成，增加其降解，干预脂肪性肝纤维化进程。

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英文缩略词表

引言

1.脂肪性肝纤维化与ERS

2.脂肪性肝纤维化与SIRT1/3

材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 实验药品

1.1.3 实验试剂

1.1.4 主要试剂的配制

1.1.5主要仪器与设备

1.2 实验方法

1.2.1 木瓜提取物对小鼠肝脏的保护作用

1.2.2 木瓜提取物对小鼠肝脏的保护作用机制研究

1.2.3 统计学处理

实验结果

第一部分 木瓜提取物对脂肪性肝纤维化小鼠的肝脏保护作用

1.1 木瓜提取物的指纹图谱

1.2 木瓜提取物对脂肪性肝纤维化小鼠每日摄食量、饮水量、形态及肝重、体重的影响

1.3 木瓜提取物对脂肪性肝纤维化小鼠的肝功能及血脂的影响

1.4 木瓜提取物对脂肪性肝纤维化小鼠肝脏的组织病理学影响

1.5 木瓜提取物对与纤维形成相关的COL1A1、α-SMA、TIMP-1和Hyp含量的影响

第二部分 木瓜提取物对脂肪性肝纤维化小鼠肝脏保护作用的机制研究

1.1 木瓜提取物对脂肪性肝纤维化小鼠炎症偶联ERS相关因子的影响

1.2 木瓜提取物对SIRT1/SIRT3通路相关蛋白的影响

讨论

结论

参考文献

综述: DNA条形码鉴定药用植物的研究进展

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著